妊娠對肺動脈高壓肺循環影響的實驗研究

李 月 金 沐 景 赫 孫雨薇 程衛平

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指靜息狀態下經肺動脈導管測量平均肺動脈壓≥25mmHg(1mmHg=0.133kPa)的病理狀態[1]。妊娠因其血流動力學變化加重心肺循環負擔，可以導致肺動脈高壓[2]，被認為是PAH禁忌[3-4]。我們前期發現，妊娠合并肺動脈高壓患者中96.7%的患者合并有先心病[5]，而國外報道中，64%為合并特發性肺動脈高壓(idiopathic PAH，IPAH)[6]。我們同時發現，無論類型是否相同，大多數產婦死亡事件都發生在分娩后的第一個月內[12]。為此，建立妊娠合并肺動脈高壓的動物模型、探尋產后PAH患者死亡的原因，具有明顯臨床意義和研究價值。

本實驗計劃在MCT誘導PAH大鼠模型的基礎上建立妊娠合并PAH大鼠模型。并通過此模型，觀察妊娠對PAH大鼠肺循環的影響，探索影響終止妊娠后PAH產婦發生嚴重心臟不良事件的原因。

材料與方法

1.實驗動物及分組 本實驗使用雌性,SD大鼠，依照首都醫科大學附屬北京安貞醫院實驗動物飼養與使用指南，飼養于北京安貞醫院實驗動物飼養中心(SYXK(京)2016-0027)。所有大鼠提供充足的食物和水源，飼養環境為24h的亮暗光照循環，空氣濕度50%～60%，溫度20～22oC。

將大鼠隨機分為四組：①空白對照組(n=15)，②野百合堿(MCT)組(n=20)，③妊娠組(n=16)，④妊娠MCT組(n=20)。四組大鼠均每周稱重1次，稱重同時按“活躍”、“一般”及“不活躍”記錄一般狀態。

2.肺高壓模型的建立 經過1周適應性飼養之后(即7周齡)，MCT及妊娠MCT組大鼠通過頸背部單次皮下注射配制好的MCT(Sigma-Aldrich, 美國；劑量：60 mg/kg)的方法來誘導PAH。對照組及妊娠組給予相同容量的0.9%氯化鈉溶液。

3.妊娠模型的建立 在大鼠9周齡時，妊娠及妊娠合MCT組大鼠開始進行合籠(雌雄共養)。按照雄∶雌=1∶2～3的比例進行合籠，時間從每天20:00到次日8:00。每天早上結束合籠時檢查雌鼠的陰栓，若可見陰栓即認為合籠成功，否則繼續合籠。為控制合籠成功時間差距過大導致的實驗誤差，將合籠不成功大鼠繼續合籠時長限制在1周之內。

4.血流動力學測量 在記錄成功合籠時間的18d后，即達到大鼠的妊娠晚期，進行血流動力學指標測量。合籠前對照組及MCT組中體重(相差≤5g)及一般狀態與妊娠組及妊娠MCT組相近的大鼠，在同一天采集指標。首先使用3%戊巴比妥鈉(2～3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，按7mL/kg的潮氣量，50次/min的呼吸頻率，和2.5cmH2O(1 cmH2O=0.098kPa)的呼末壓力進行機械通氣[18](呼吸機：奧爾科特ALC-V8，上海)。經右側股動脈置管(BD Insyte-W 24G, 美國)實時監測體循環壓力(SAP)變化；開胸后經右心室置管于肺動脈主干，實時監測肺動脈壓力(PAP)變化(壓力換能器：Edwards PX260，美國；監護儀：Hewlett M1 166A，美國)。

5.肺動脈形態學測量 結束血流動力學測量后，麻醉狀態下處死大鼠。留取大鼠右肺中下葉固定于4%多聚甲醛溶液，經石蠟包埋及HE染色(染色液：中杉金橋ZLI-9615，北京)，制成5μm厚切片。每只大鼠光鏡(尼康Eclipse 90i, 日本)下觀察10～12個直徑50～200mm的肺中小動脈，通過計算相對中膜厚度評估肺血管重塑程度(照相：尼康DS-Ri1-U3，日本；測量：Image Pro Plus 6.0, 美國)。相對中膜厚度由以下公式求得：(ED-ID)/ED x 100% (ED, 外徑; ID, 內徑)[19]。另外統計平均每只大鼠10個低倍鏡視野下的肺血管密度(個/mm2)，并分別統計增厚肺小血管密度，非增厚肺小血管密度及阻塞肺小血管密度。

6.統計學方法 實驗數據均通過SPSS 22.0統計分析。經正態性及方差齊性檢驗后，符合正態分布及方差齊的計量資料以均數±標準差表達, 采用方差分析，兩兩比較采用SNK 法檢驗; 不符合正態分布數據以中位數(四分位數間距)表達，采用秩和檢驗。計數資料以頻數(率)表示,采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

在注射MCT后、進行血流動力學測量前，MCT組共死亡8只大鼠，妊娠MCT組共死亡6只大鼠。而妊娠組有4只未合籠成功，妊娠MCT組未死亡大鼠中有2只未合籠成功。最終，各組大鼠例數分別為：①空白對照組(n=15)，②MCT組(n=12)，③妊娠組(n=12)，④妊娠MCT組(n=12)。

1.MCT增加大鼠肺循環壓力 空白對照組與MCT組PAP比較 [(19.33±5.39)vs. (33.5±5.49)mmHg，P<0.001]顯著降低，PAP/SAP[37.31(27.73，42.71)vs.77.82(53.33，100)%，P<0.001]也呈同一趨勢, SAP [(53.93±10.91)vs. (44.17±16.75)mmHg，P=0.079] 差異無統計學意義。與妊娠組PAP [(19.33±5.39)vs.(19.42±2.61)mmHg]；PAP/SAP [37.31(27.73，42.71)vs. 34.59(33.33，36.96)%]，及SAP比較,差異無統計學意義。與妊娠MCT組 PAP[(19.33±5.39)vs.(26.25±5.53)mmHg,P=0.001]及PAP/SAP比較[37.31(27.73，42.71)vs.54.65(36.84，71.11)%，P=0.013]均顯著降低; SAP [(55.75±11.30)vs. (50.83±18.32)mmHg，P=0.435] 差異無統計學意義(圖1)。

圖1 各組大鼠PAP及SAP水平注：與空白對照組相比，aP<0.001；妊娠MCT組vs.妊娠組，bP<0.01；MCT組vs.妊 娠MCT組，bP<0.01

2. MCT損傷大鼠肺血管基本形態 (1)與空白對照組及妊娠組對比，MCT組及妊娠MCT組大鼠的肺組織切片顯示，肺小動脈內膜明顯增生，可見微血管瘤形成及小血管阻塞。光鏡下可見此兩組大鼠的肺動脈管壁平滑肌層明顯增厚，管腔縮小(圖2)。

(2)大鼠肺小動脈相對中膜厚度 四組大鼠相對中膜厚度的比較可見: MCT組大鼠較空白對照組 [(38.00±11.56)vs. (23.87±3.78)%，P<0.001] 相對中膜厚度明顯增厚; 妊娠MCT組大鼠較妊娠組 [(34.83±6.37)vs. (29.08±4.66)%，P=0.019] 相對中膜厚度明顯增厚(圖3)。

(3)大鼠的肺小動脈密度 各組大鼠的肺小動脈密度分析結果顯示:MCT組及妊娠MCT組大鼠總肺小動脈密度、增厚肺小動脈密度及閉塞肺小動脈密度的增加,差異均有統計學意義(P<0.05)，而未增厚肺小動脈密度明顯小于其他兩組 (P<0.05,表1)。四組不同程度中膜厚度肺小動脈數量占總肺小動脈數量的比例的結果, 進一步驗證了表1結論。MCT組及妊娠MCT組大鼠增厚及閉塞肺小動脈密度的比例也明顯高于另外兩組(表2)。

表1 各組大鼠肺小動脈密度 個/mm2)

注：MCT組與對照組比較,aP<0.001，P<0.05; 妊娠MCT組與妊娠組比較，aP<0.001；妊娠MCT組與MCT組比較，bP<0.01

圖3 四組間肺小動脈相對中膜厚度對比注:與空白對照組比較，aP<0.001, bP<0.01；與妊娠組比較，cP<0.05

組別未增厚肺小動脈比增厚肺小動脈比閉塞肺小動脈比空白對照組(n=15)96.92.630.5MCT組(n=12)34.3a33.732.1妊娠組(n=12)94.94.710.4妊娠MCT 組(n=12)24.3a46.828.9

注:對照組與MCT組比較,aP<0.001; 妊娠MCT組與妊娠組比較，aP<0.001

3.妊娠對大鼠肺循環呈雙向影響 血流動力學方面，妊娠MCT組較MCT組大鼠[(26.25±5.53)vs.(33.5±5.49)mmHg，P=0.004] PAP的降低,差異有統計學意義(圖1)。肺動脈形態方面，妊娠MCT組較MCT組大鼠[ (3.55±0.81)vs. (2.27±0.84)個/mm2，P=0.001]有更多增厚的肺小動脈(表1)；妊娠組較空白對照組大鼠[(29.08±4.66)vs.(23.87±3.78)%，P=0.004]相對具有更厚的肺小動脈中膜(圖3)。

討 論

實驗結果顯示，MCT能夠顯著增加肺循環的壓力，從血流動力學方面驗證了PAH模型的成功建立。肺動脈高壓患者診斷的金標準就是PAP的升高，本實驗所有經MCT誘導的大鼠其PAP的增高都具有顯著的統計學差異，已足夠確定PAH模型的建立。而臨床醫生考量PAH患者病情的危重程度則要綜合PAP及SAP的水平，所以經MCT誘導大鼠具有更高的PAP/SAP水平也更加驗證了這一模型建立成功的可信度。

MCT損傷大鼠肺血管基本形態則從病理學角度驗證了PAH模型的成功建立。氧化應激、肺循環內膜功能障礙及血管重塑都是導致PAH的重要原因[1]。MCT通過肺血管內膜功能障礙及血管重塑來破壞肺血管結構[20]，進而導致肺血管收縮、增殖及阻塞性改變，從而誘發肺血管阻力升高，這是其誘導肺動脈高壓模型的機理[21]。肺血管高阻力限制了肺動脈血流，增加了肺主動脈及右心負荷，進而導致肺動脈及右心室壓力升高[22]。本實驗病理組織檢查中，顯著的肺血管增生增殖及阻塞性改變都得以復制，包括相對中膜厚度增厚、肺小動脈數量增多及出現閉塞小動脈。進一步驗證了PAH大鼠模型建立的成功。

在進行血流動力學測量時(即合籠成功18d后)，已處于妊娠大鼠的孕晚期，此時增大的子宮可通過直視觀察到，從而確定妊娠模型的成功。通過以上方法，確定了本實驗結果中所統計妊娠組及妊娠MCT組大鼠符合預期研究模型的質量要求。

除以上結果，本實驗還顯示了妊娠因素對大鼠肺循環的特殊影響。首先，PAP及PAP/SAP的水平在妊娠MCT組明顯低于MCT組大鼠，這說明妊娠過程對PAH存在保護性作用。但來自這兩組大鼠的增厚肺小動脈數量，則在妊娠組增長的更為顯著，這顯示妊娠同樣也能加重肺血管結構的破壞。另兩組之間，妊娠組比空白對照組具有更厚的肺小動脈相對中膜厚度，也進一步驗證了妊娠對肺血管結構帶來的不良影響。這兩個看似互相矛盾的結果，提示了妊娠對肺循環的影響可能存在更復雜的機制，妊娠期間可能同時存在保護肺循環與損傷肺血管的因子。下面是有關這一設想的一些證據。

大量臨床資料統計顯示，妊娠合并PAH患者的死亡事件多發生于終止妊娠之后。分娩后的第一周內被認為是臨床上最危險的時間段[7]。分娩致使回心血量劇增極易導致此類患者發生心力衰竭，這已成為妊娠合并PAH產后死亡的首要原因[8-11]。其它重要的死因還包括妊娠高凝狀態導致的肺栓塞及腦栓塞等。這些伴隨妊娠的特殊病生理狀態需要在終止妊娠6-8周后基本恢復到正常水平[23]。但是在這些統計資料中，還存在大于終止妊娠后8周甚至是終止妊娠半年后的遠期死亡事件。所以，我們推測還存在某些與妊娠相關的因素，能夠對肺循環造成影響，本研究實驗結果中發現的肺小動脈形態學損傷性改變，由于其不可逆性，或許與終止妊娠后稍晚期肺動脈高壓的死亡情況相關。

由于IPAH具有顯著的年輕育齡女性高發傾向，許多研究開始關注性激素與PAH之間的關系[2, 24-26]。這一流行病學特征，顯示出雌性激素具有加重PAH的影響。但另一項發現卻與之相悖，即一旦患上PAH，女性患者通常比男性患者具有更輕的病情及更好的預后[27]。提示，雌性激素可能對PAH患者病情具有雙向的影響。同時，雌性激素作為孕期顯著增長的特征性激素，是妊娠期間最具代表性的特殊血清學成分之一。那么，妊娠后雌性激素水平變化，很可能就是實驗中所觀察到對肺循環具有雙向作用的因子。

大量研究證明，女性特征性的雌激素及孕激素都具有明顯擴張肺血管的作用[12]，這似乎可以解釋女性PAH患者較男性病情輕的特點。或許與性激素對PAH肺循環的保護性作用有關。目前，對性激素加重PAH病情的確切機制尚無定論。大多動物實驗將焦點放在對雌激素的主要活性成分雌二醇(17β-estradiol，E2)的研究上。一些動物實驗發現，E2能促進肺血管的增殖，并且有促有絲分裂、促血管增生以及抗凋亡的作用，從而加重對肺血管的破壞，給肺循環帶來的不利影響[26, 28]。低氧、炎癥及某些藥物的影響下，E2對肺循環的破壞性作用更會加重。所以，雌激素或許就是我們所猜想的這一重要因子。

目前，關于雌激素與PAH的研究很多，但不同的動物模型以及不同劑量的外源性雌激素，導致了實驗的結果很不一致。值得注意的是，目前尚未出現任何一項直接在妊娠合并PAH大鼠模型上進行的相關研究。這為接下來的研究提供了方向。

綜上所述, 本實驗成功建立了妊娠合并PAH大鼠模型。同時，發現了妊娠對于PAH大鼠肺循環的雙重影響。雌激素很可能是雙重影響的主要介導者，在PAH患者妊娠期間，雌激素在擴張肺血管的同時，也加重了肺小動脈不可逆的組織學損傷。以上改變可能是妊娠對PAH肺循環雙向影響的重要機制之一。