幼豬體外循環腦灌注血流/壓力動物模型的構建

姚婧鑫 魏新廣 王小龍 李勇男 龍 村 林栓同 梁 影 姜福清 管玉龍

全球新生兒中先天性心臟病的發病率為5～8/1 000[1]。隨著先天性心臟病患兒術后死亡率顯著降低，這些患兒術后神經系統的預后受到更多關注[2]。在接受先天性心臟病矯治手術的患兒，術后中樞神經系統損傷的總體發病率為30%～70%[3]。大腦是機體代謝最為活躍的器官之一，對缺血缺氧極其敏感。腦血流的穩定對于腦灌注的滿足具有決定性作用[4]。傳統理論認為，人體內存在腦血流自我調節機制作為一種生理性保護，在一定血壓波動范圍內可使腦血流量維持相對恒定。腦血流自我調節機制的血壓閾值為50～150mmHg (1mmHg=0.133kPa)[5]。但在心血管外科實踐中，嬰幼兒體外循環(cardiopulmonary bypass，CPB)中平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)一般控制在30～50mmHg，低于經典定義閾值下限50mmHg。嬰幼兒CPB期間，在低于閾值血壓條件下的腦血流調節機制變化狀況，腦灌注是否受灌注流量的影響未見報道。本實驗擬通過構建幼豬腦血流/壓力模型，探討CPB期間不同血壓水平、灌注流量對腦血流自我調節的影響。

材料與方法

1.實驗動物和分組 幼豬20只，周齡(4.1±0.6)周，體質量(4.4±0.8)kg。4只幼豬為對照組(C組)僅行開胸術(n=4)。其余16只幼豬根據主動脈阻斷期間的灌注流量，隨機分兩組(n=8)：高流量組(H)、低流量組(L)，每組根據主動脈阻斷期間MAP再次分為高血壓(H1和L1)和低血壓(H2和L2)兩個亞組(n=4)。高流量組動物控制主動脈阻斷期間CPB流量100～120 mL·min-1·kg-1，低流量組CPB流量50～70 mL·min-1·kg-1；高血壓控制主動脈阻斷期間MAP維持在50～70mmHg，低血壓組控制MAP維持在30～50mm Hg。本實驗通過阜外醫院和實驗動物倫理委員會批準，嚴格遵守實驗動物倫理要求。

2.麻醉和體外循環管理 (1)麻醉：苯巴比妥鈉 20～40mg/kg靜脈注射，行氣管插管機械通氣。使用容量控制模式實施機械通氣，呼吸頻率為25～35 次/min，潮氣量10mL/kg，吸氣氧濃度 0.6，吸呼比 1∶1.5。單側股動脈穿刺置管監測動脈血壓、抽血進行血氣分析，開放耳緣靜脈補液和給藥。實驗過程中，使用七氟醚、舒芬太尼維持麻醉在適宜深度；持續監測心電圖、鼻溫和肛溫。每5min記錄一次腦氧飽和度監測(regional cerebral oxygen saturation，rSO2)、MAP、體溫等數據。

(2)體外循環 CPB裝置包括：S5人工心肺機(LivaNova PLC，倫敦，英國)、CAPIOX RX05 嬰兒膜肺(Terumo，東京，日本)和嬰兒D管路(天津塑料研究所，天津)，Capiox? AF02嬰兒動脈過濾器，在動脈過濾器與膜式人工肺儲血室之間連接HEMOCONCENTRATOR BC 20 血液濃縮器。采取正中開胸方法進行CPB插管。為實時監測腦組織灌注流量，本研究采用主動脈和頸總動脈干單泵雙管灌注(圖1)，整體主動脈插管為10F(Terumo，東京，日本)，右心房靜脈插管為22F(天津塑料研究所，天津)，頸總動脈插管為6F(Terumo，東京，日本)。使用TS410血流檢測儀(Transonic Systems Inc.，Ithaca，紐約，美國)，ME6PXL-M9107型管路探頭實時監測體外循環主動脈插管灌注流量、頸總動脈插管灌注流量(代表腦組織灌注流量)。采用含血預充液，包括200mL醋酸林格氏液和200mL同種異體全血，預充液中加入400 IU/kg的肝素。CPB轉中血氣管理為α穩態。CPB轉流30min后，鼻溫和肛溫降至32℃阻斷升主動脈，使用 4℃, St. Thomas晶體停搏液灌注實施心肌保護。阻斷期間不同組別控制不同的灌注流量和灌注壓力。心臟停搏40min后開始復溫，鼻溫和肛溫恢復至35℃,開放升主動脈，阻斷時間均為60min。復溫過程中，溫差不超過5℃。復跳后輔助20～30min，并根據血液稀釋情況應用血液濃縮器濾除多余的水分。實驗過程中，使用去甲腎上腺素和尼卡地平將血壓控制在適宜范圍。總CPB時間大約為120min。

3.生理學指標測量和標本采集 (1)監測時間點：在CPB開始前10min(T0)、CPB開始后10min(T1)、升主動脈阻斷后30min(T2)和升主動脈開放后10min(T3)4個時間點抽取動脈血樣，將采集血標本置于4℃，離心機 3 000r/min,離心,15min后取上清，置于-70℃冰箱中保存。實驗結束后使用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)集中檢測血清S100B蛋白和神經元特異性烯醇化酶(neuronal specific enolase，NSE)濃度。血氣分析在T0、T1、T3這3個時間點檢測(Nova Biomedical, 沃爾瑟姆，美國)。每5min記錄一次rSO2值、MAP值、體溫等數據。

(2)局部腦氧飽和度監測：使用NIRO200腦氧飽和度儀(日本濱淞公司，日本)監測rSO2進行腦灌注效果的實時監測，氧飽和度探頭至于前額正中，眼眶上1cm處。

表1 幼豬CPB前一般情況

注： H:高流量；L:低流量；MAP:平均動脈壓；rSO2:局部腦氧飽和度；HGB:血紅蛋白

4.組織學檢測 實驗結束后經頸總動脈插管，用約5L，冰0.9%氯化鈉溶液沖洗至靜脈液體清亮后，灌注約1.5L多聚甲醛固定腦組織。隨后取出海馬組織，將其置于10% 多聚甲醛中24h。石蠟包埋切片，切片厚度5μm，二甲苯脫蠟后，使用無水乙醇進行脫水，分別進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、尼氏染色。使用光學顯微鏡觀察海馬角(cornuammonis，CA)細胞凋亡、壞死并計數[6]。

5.免疫組織化學檢測 采用免疫組織化學檢測大腦海馬組織缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α)，凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)和硫胱胺酸蛋白酶3(Caspase-3)的表達。樣本首先進行抗原修復，使用0.01 mmol檸檬酸緩沖液(pH=6.0)于高壓鍋煮沸2min。冷卻后，使用過氧化氫阻斷內源性過氧化氫酶20min。分別使用一抗，抗AIF-1 (羊多克隆抗體 1∶500, Abcam, 英國)，抗HIF-1α (小鼠多克隆抗體 1∶500, Abcam, 英國)，抗caspase- 3(兔多克隆抗體, Santa Cruz, 美國)，在4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗后使用IgG辣根結合抗羊/兔/小鼠抗兔二抗(中杉金橋，北京)室溫下孵育30min，PBS沖洗后使用二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色。拍攝收集圖像使用萊卡 DM6000B 在20倍目鏡下進行。圖像分析使用Image-Pro- Plus 6.0 軟件(圖像分析系統, 美國)。

6.統計學分析 統計軟件為SPSS 23.0。計量資料使用均數±標準差表示，兩組均數比較采用t檢驗。亞組每個時間點的組間差異使用單因素方差分析。不同時間點組間重復測量資料的分析使用析因重復測量方差分析。卡方檢驗用于免疫組化結果的組間差異的析因分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.生理學監測指標 各組幼豬轉前的一般生理學指標，不同時間點幼豬體溫、PaCO2、HGB、CPB時間及復溫時間組間,差異均無統計學意義(表1～2)。

2. CPB流量、腦灌注流量及灌注效果監測 將實驗動物按照灌注流量分為高流量和低流量分組后(n=8)，高流量組和低流量組CPB總灌注流量在阻斷前和開放后差別不顯著(P>0.05，表3)。T2時間點L組動物的總灌注流量(67.1±1.8)mL·min-1·kg-1顯著低于H組動物(104.5±4.8)mL·min-1·kg-1(P<0.001)。通過ME6PXL-M9107型管路探頭可以實時監測到頸總動脈插管內進入腦動脈的灌注流量。H組動物，3個時間點的腦流量(cerebral blood flow，CBF)未發生顯著變化(P>0.05)，而L組動物在T2時間點腦灌注流量(18.4±6.7)mL·min-1·kg-1遠遠低于H組(28.8±7.6)mL·min-1·kg-1(P=0.009)，在T3時間點，低流量組動物的CBF(21.6±5.6)mL·min-1·kg-1仍然顯著低于高流量組動物(29.0±6.7)mL·min-1·kg-1(P=0.024，圖2)。

將高流量和低流量組動物按照灌注壓力不同分為四個亞組后，其各組腦灌注流量結果見表4，對于高流量組動物，灌注壓力發生變化時，其分組腦灌注流量沒有發生顯著變化(P>0.05)；L組的腦灌注流量存在低于H組的趨勢，但是這種降低差異無統計學意義(P=0.072，圖3)。

rSO2從 T1開始降低，重復測量方差分析顯示L組亞組中不同時間rSO2不同(P=0.028，圖2)。單因素方差分析顯示，T2時間點各組rSO2差異有統計學意義(P=0.016)。其中，L2組rSO2低于其他各組rSO2值(P<0.05，表5，圖3)。

表2 不同時間點體溫、PaCO2和HGB監測結果

圖1 單泵雙管腦灌注動物模型；圖2 CPB灌注流量及腦灌注流量

圖3 H組和L組亞組各時間點流量、MAP、rSO2

3.血清S100 B和NSE水平 血清S100B水平從CPB開始逐漸升高，組間變化趨勢差異有統計學意義(P=0.048)。S100B 水平的最高值出現在T2，其中LL組顯著高于HL組(P=0.032)。在T3時，各組S100 B水平與基礎值相比差異無統計學意義(P>0.05)。S100B和NSE的析因重復測量方差分析結果顯示，分組×時間在各組間差異無統計學意義(圖4)。

表4 不同時間點灌注流量監測結果

表5 不同時間點rSO2的比較

圖4 S100B和NSE檢測結果

監測點流量H組(n=8)L組(n=8)P值T1CBF27.6±8.724.6±4.10.451總流量90.8±19.192.5±11.90.829T2CBF28.8±7.618.4±6.70.009總流量104.5±4.867.1±1.80.001T3CBF29.0±6.721.6±5.60.024總流量104.5±5.197.4±11.20.123

4.組織學級免疫組化結果 HE染色結果顯示，海馬 CA 區錐體細胞排列有序，未見細胞核固縮深染以及細胞嗜伊紅染色，即無明顯壞死和凋亡的神經元(圖5)。尼氏染色結果中，神經細胞著色均勻且排列有序，且細胞計數結果在各組間差異無統計學意義(圖6)。Caspase-3在各組均未發現明顯表達(圖7)。HIF-1a和AIF在各組海馬錐體細胞中均有表達，其位置位于細胞質內，但組間差異無統計學意義(圖8～9)。

圖5 組織病理HE染色

圖7 Caspase-3 在各組均未發現明顯表達

圖8 HIF-1a表達組間差異不顯

圖9 AIF表達組間無差異

討 論

經典的腦血流自動調節機制作為一種保護機制，其經典定義為血壓在50～150mmHg范圍內腦血流相對保持穩定，但是這種自我調節機制是建立在全身灌注流量充足的前提下。兒童的腦血流自動調節閾值尚未得到統一的結論。本實驗通過構建幼豬腦灌注血流/血壓模型來探討CPB期間灌注流量和灌注血壓對腦灌注的影響。盡管經顱多普勒直接檢測大腦中動脈血流是腦灌注監測的最直接方法，但是在預實驗中進行監測發現，幼豬的大腦中動脈監測效果重復性差，流量監測不穩定。而在前期的小型豬主動脈解剖發現，小型豬主動脈弓部發出兩個大的分支，右側為右頭臂動脈，左側為左鎖骨下動脈，左頸動脈由右側頭臂動脈發出[7]。因此課題組成功建立單泵雙管灌注模型，腦灌注選擇經頸總動脈進行，使用TS410血流檢測儀實時監測進入雙側頸動脈血管的灌注流量，從而代表了雙側頸內動脈的灌注量。這也是我們成功構建幼豬CPB腦灌注血流/壓力動物模型的關鍵。除了灌注流量，腦灌注效果的監測通過近紅外分光光度技術(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)進行rSO2的監測來完成。NIRS作為一種無創的監測手段，在預測重癥患者和心外手術患者的預后有著良好的相關性[8-10]。Addison的研究結果顯示，作為一種簡單易行的手段，NIRS可以穩定的分析腦血流自動調節的變化[11]。在本實驗中，通過監測rSO2來間接反映腦血流自動調節的變化。

在心血管手術，尤其是嬰幼兒心血管手術，大多數需要CPB的輔助支持，作為一種非生理性的灌注方式，轉流過程中由于患者病變類型的不同、外科術式的改變，可能引起灌注流量和灌注壓力的改變。在并行循環階段，心臟自身仍存在射血，因而全身灌注一般可以得到保證。但是在主動脈阻斷期間，全身的灌注流量完全依賴于CPB的灌注，此時灌注流量和灌注壓力的變化可能引起腦灌注量的變化。這些假想也在本組實驗中得到證實。本研究結果顯示，在主動脈阻斷期間，給予50～70mL·kg-1·min-1的低CPB血流，L組動物在T2時間點腦灌注流量遠遠低于H組，而且這種腦灌注流量的降低還延續到開放升主動脈后。因此阻斷期間的低流量灌注對于開放后的腦灌注也有一定的不良影響。這提示在術中實施低流量的嬰幼兒手術，后并行階段需要采取措施，逆轉腦灌注不足造成的不良影響。盡管在手術中需要一定階段的低流量，但是灌注壓力是可以調控的因素。在本實驗中，L2組的rSO2明顯低于其余三個組別，而H組的亞組間沒差異有統計學意義，因而提示主動脈阻斷后低CPB流量期間的腦血流/壓力自我調節機制受損，維持較高的動脈灌注壓力，一定程度上有助于抵消或者代償低流量造成的潛在性腦缺血缺氧損傷。

S100 B蛋白和NSE作為傳統的神經化學生物標記物，在心跳驟停、顱外傷、休克以及心臟手術后存在認知功能障礙的患者中，其水平都會顯著增高[12-14]。本研究中，在S100B最高值和rSO2最低值均出現在T2時間點，其中L2組在T2點的rSO2監測顯示其發生較明顯的腦灌注不足。Rezaei的研究顯示，S100B對于血腦屏障的損傷敏感度較高[15]，在本研究中S100B的趨勢和rSO2和也較為一致。

HIF-1是一種在缺血后上調的異源二聚體轉錄因子[16]。HIF-1有兩個亞型，其中β亞型持續表達，α亞型的表達受低氧調控。在大鼠腦局灶性梗死模型中HIF-1α表達顯著增加[17]。動物實驗發現，HIF-1α在急性腦梗死模型早期發揮了神經保護作用[18]。本研究中，HIF-1α在各組中均有表達但無組間差異。可能是由于麻醉誘導以及頸動脈插管造成一過性腦血流減少，進而引起HIF-1α表達以發揮神經保護作用。AIF是Caspase非依賴性細胞凋亡因子。當存在腦損傷時，AIF由細胞質的線粒體轉移到細胞核[19]。在本研究中，AIF表達位置位于細胞質中，且組間差異無統計學意義。Caspase-3在各組中沒有發現明顯的表達。在Chen等的研究中報道中，Caspase-3在深低溫停循環時有表達[20]，而在本組實驗中，僅僅在主動脈阻斷期間有低流量損傷因素，開放升主動脈后，各組動物的灌注流量均恢復至阻斷前水平，這種設計是臨床實踐的模擬。由于實驗中損傷程度較輕，因此并未引起Caspase-3表達。尼氏小體，又稱尼氏物質，在神經元缺血缺氧的情況下會消失或溶解。因此，尼氏小體常用作神經元細胞功能狀態的指標。在本研究中，尼氏染色在各組間差異無統計學意義。同時，HE染色也沒有發現壞死和凋亡現象。這也能證實豬動脈阻斷后單純短時間的低流量灌注(50～70 mL·min-1·kg-1)，其引起的腦損傷程度有限。

本組動物實驗也存在一些局限性。首先，本研究是急性研究，我們無法檢測遠期神經化學生物標記物表的變化。Kunze的研究發現，在大鼠模型中腦微小壞死引起的海馬CA區神經元壞死發生在腦損傷24h之后[21]，本研究的取材時間較早，可能無法觀察到后期的變化。其次，實驗中使用的小豬是正常小豬，可能和存在先天性心臟病的嬰幼兒存在差異。研究中的高血壓和低血壓控制是采用縮血管藥物和血管擴張藥物控制，此時藥物引起的腦灌注流量變化，與先心病患兒術中的生理反應性血壓可能存在區別。實驗中頸總動脈插管，這樣的優點是可以采用管路探頭直接監測管道內的灌注流量，但是插管型號以及插管位置的阻力因素，也是在今后的實驗中需要考慮的因素。另外，實驗中可能還有其他因素包括麻醉藥物等沒有涉及。

本研究成功構建了幼豬體外循環腦灌注血流/壓力動物模型。在主動脈阻斷期間，低CPB血流可以造成全身和腦灌注不足，腦血管自我調節機制不能抵消低流量造成的腦灌注不足損傷。此時維持較高的動脈灌注壓力，有助于在一定程度上代償腦灌注不足引起的缺氧狀況。