阿托伐他汀對兔主動脈瓣鈣化性病變炎癥反應影響的研究

任 瞳 李繼勇 張健群 師 闖

鈣化性主動脈瓣疾病(calcific aortic valve disease, CAVD)是一類常見的心臟瓣膜疾病，主要表現為瓣膜組織增厚、硬度增加以及鈣化[1]，是提高心血管疾病發生率和病死率的主要原因[2]，已成為重要的公共衛生問題[3-4]。研究發現，CAVD可在血流動力學沒有顯著梗阻的情況下，使心血管原因死亡的風險提高到50%，極大地加重了社會和家庭的經濟負擔[5]。目前臨床尚無有效的醫療手段預防或逆轉CAVD 的發病過程，其發病機制亦尚無定論[6]。既往觀點認為，CAVD是一種與年齡相關的退行性病變，但越來越多的證據表明CAVD不僅與年齡相關，更是一個主動的與動脈粥樣硬化類似的病理生理過程[1]。研究指出阿托伐他汀具有強效降脂功能，還具有抗炎、改善內皮細胞功能和抗氧化應激反應等作用[7-8]。但目前關于CAVD早期病理改變的兔模型鮮有報道。本研究旨在通過建立發生CAVD早期病理改變的兔模型，觀察實驗個體中主動脈瓣膜的組織學改變及阿托伐他汀干預對兔主動脈瓣鈣化性病變炎性指標的影響，并探討CAVD相關的病理機制及可能的治療靶點，現報道如下。

材料與方法

1.動物模型建立 選擇健康，新西蘭純種，雄性，白兔，45只，體質量 2.0～2.5kg，按清潔級動物分籠喂養，適應性喂養1周后，隨機分為三組，正常對照組(N 組)：15只，喂飼普通顆粒兔飼料；高脂飲食組(HC組)：15只，予高脂飲食喂養；高脂飲食加阿托伐他汀干預組(AI組)：15只，高脂飲食喂養同時予阿托伐他汀4mg·kg-1·d-1)灌胃；同期 N、HC 組均分別給予同等劑量0. 9% 氯化鈉溶液灌胃。并將實驗開始及第 4、8、16 周為固定時間點，各測兔體質量一次，以觀察其生長情況并調整藥物劑量。

2.血標本采集及測定 于實驗開始后第 4、8、12 周，抽取空腹兔耳緣靜脈血3～5mL，即刻送首都醫科大學附屬安貞醫院檢驗科進行指標測定，包括：TC、TG、LDL-C、HDL-C、肌酸激酶(CK)、谷丙轉氨酶(ALT)及高敏C反應蛋白(hs-CRP)。

3.瓣膜標本采集、制備及測定 瓣膜標本采集于實驗開始后第4周末，于解剖實驗室，對各組各取一只兔子經耳緣靜脈注入苯巴比妥 50 mg / kg 處死，隨即剖開胸部，摘除心臟，并沿著血流方向剪開心臟，暴露各心腔和瓣膜，取得實驗兔的主動脈瓣膜；第8周于三組中再各隨機挑取一只兔子，按上述方法取得主動脈瓣膜；第12周取剩余兔子的主動脈瓣膜標本。所有標本均用磷酸鹽緩沖液洗去血漬后，固定于 10% 的甲醛中，經過同樣梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，用組織切片機切 3μm 超薄石蠟切片。

4.標本HE染色 利用標準HE染色觀察瓣膜組織構架，包括瓣葉的厚度、炎細胞及纖維細胞的數量、鈣化情況、膽固醇結晶、泡沫細胞和毛細血管等的出現。

5.免疫組織化學染色 將石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，加一抗(TNF，型號JM6183，比例1∶200；IL-6，型號JM1908，比例1∶200)，加二抗(山羊抗兔鼠通用，型號DAKO K5007，比例：即用)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色，復染細胞核，脫水封片后行顯微鏡鏡檢，圖像采集分析，觀察炎性因子TNF-α和IL-6在標本中的表達。(以上試劑購自北京嘉美臻元生物科技有限公司)。

6.判斷標準 組織學和免疫組化的染色結果判斷：每組組織學和免疫組化的染色結果均由兩位或三位有經驗的觀察者進行評估。每張切片均被系統地觀察，分別在瓣膜切片取瓣尖、中間1/3和基底部3個視野(×200及×400)，評估各個主動脈瓣膜組織的特征，對比觀察各樣本中陽性結果的表達及其程度。

7.統計學分析 采用 SPSS 20.0進行統計學處理。先對測量結果進行正態檢驗和方差齊性檢驗，計量資料以均數±標準差表示，三組間比較時采用方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.體質量及檢驗指標結果 各實驗組個體均無中途患病及死亡情況。三組樣本兔體質量均隨喂養時間增長而升高，三組之間體質量變化，差異無統計學意義(表1)。血液檢驗指標提示4周后，與N組相比，HC組TC、TG、LDL-C及 hs-CRP均升高，且差異具有統計學意義(P<0.05)，AI組在上述4項指標中同樣明顯升高，但明顯低于HC組增高水平(P<0.05)，其余指標差異不顯著(P>0.05)。8周及12周后，HC組TC、TG、LDL-C及hs-CRP較第4周明顯升高，而AI組上述4項指標雖也呈現升高趨勢，但數值明顯低于HC組，且差異具有統計學意義，此外AI組ALT及HDLD-C分別與N組及HC組相比，差異有統計學意義，但其他指標差異不顯著(表2)。

2.肉眼外觀 第4周：三組瓣膜標本均平整、致密、柔軟、光滑，未見明顯病理改變。第8周：HC組瓣膜較第4周增厚，但表面光滑、柔軟，未見鈣化斑，N組和AI組較前未見明顯異常。第12周：HC組瓣膜厚度較第8周進一步增加，其透亮度降低，瓣間及基底部可見瓣膜表面顆粒狀隆起，未見明顯鈣化斑；AI組可見標本較前增厚，透亮度較前降低，但不及HC組明顯；N組較前未見明顯異常。

3.HE染色結果 12周時，HC組瓣膜標本光鏡下可見瓣膜內膜及中膜重度增厚；胞漿內明顯的深藍色鈣鹽沉積，同時可見間質細胞化生，向軟骨和成骨樣細胞轉化(圖1A)；內膜增厚區可見大量泡沫細胞，組織可見大量脂肪浸潤(圖1B)；AI組可見內膜輕度增厚，少量泡沫細胞聚集(圖1C)；N組可見瓣膜內膜疏松，結構整齊(圖1D)。

4.免疫組化結果 12周時，三組瓣膜標本免疫組化染色結果顯示：HC組與AI組及N組比較，因子TNF-α、IL-6顯著高表達；AI組同樣可見兩因子表達，但程度較HC組低；N組未見明顯表達(圖3)。

表1 各組兔體質量對比

討 論

CAVD是心血管疾病的危險因素，也與多種心血管危險因素相關。隨著人口老齡化加劇，我國CAVD的發病率正逐年升高，已經或即將成為我國瓣膜疾病的首要病因，越來越引起人們的關注[9]。雖然人們對CAVD的病因學及病理生理過程進行了大量研究并取得了一定進展，但是目前CAVD的發病機制尚未明確，本研究借助高脂兔模型再現了早期鈣化性主動脈瓣疾病的疾病進展過程，為研究CAVD的機制及干預提供了便利。通過實驗我們發現，高脂飲食干預能夠誘導兔主動脈瓣膜發生與早期鈣化性主動脈瓣疾病相似的病理組織學改變，同時存在慢性炎癥反應的證據，包括：脂蛋白沉積、慢性炎癥、瓣膜間質細胞(VIC)向成骨細胞的過渡及進行性瓣膜小葉的纖維鈣化等，這也提示我們CAVD是一個活躍、主動的病理過程，其與動脈粥樣硬化有相似的風險因素和病理生理特點，與師闖等[10]的研究結果一致。此外，我們發現HC組瓣膜標本內膜下存在大量脂肪浸潤，在內膜增厚區可見大量泡沫細胞。而泡沫細胞是由不能被溶酶體降解的氧化型膽固醇蛋白和氧化型膽固醇共同積累后，被巨噬細胞吞噬轉化而成，最終導致斑塊及鈣化的形成。它是動脈粥樣硬化的特征性病理細胞，也存在于CAVD病灶中，這也進一步提示我們HC組瓣膜標本存在病變的發生發展。

表2 各組兔血液化驗指標對比

注：與N組相比，aP<0.05；與HC組相比，bP<0.05

圖 1 HE染色圖 A：黑色箭頭示瓣膜內斑塊；紅色箭頭示軟骨化生；B：黑色箭頭示脂肪；紅色箭頭示主動脈內斑 塊；C：黑色箭頭示泡沫細胞；D: 黑色箭頭示內膜疏松，內皮細胞輕度增生，結構整齊

圖3 免疫組化光鏡組圖 A：N組 IL-6(×200)；B：N組 IL-6(×400)；C：N組 TNF-α(×200)；D：N組TNF-α(×400)；E：HC組 IL-6(×200)；F：HC組 IL-6(×400)；G：HC組TNF-α(×200)；H：HC組 TNF-α(×400)；I：AI組 IL-6 (×200)；J：AI組 IL-6(×400)；K：AI組TNF-α(×200)；L：AI組 TNF-α(×400)

炎癥反應是心血管損害的重要病理過程，CRP作為炎癥反應指標，與心血管疾病風險呈正相關[7,11]。而研究發現，他汀類藥物除了降脂外，在一定程度上能夠抑制炎癥反應，在主動脈瓣疾病治療中發揮積極作用[2]。本研究中HC組血液檢驗結果示Hs-CRP顯著升高，免疫組化結果提示，炎性因子TNF-α及IL-6在瓣膜組織中顯著表達，而他汀干預下的AI組，上述兩因子的表達明顯低于HC組，同時Hs-CRP顯著降低，未見明顯鈣化及VIC化生，泡沫細胞的形成較少等。有研究已經證明TNF-α和IL-6各自能夠通過上調清道夫受體的表達，來促進氧化型膽固醇積累和泡沫細胞的形成，推進病情發展，其中TNF-α在病變早期的炎癥反應中起到重要作用，包括促進鈣化、激活多種炎性因子等[12]，而IL-6的高表達可導致病變過程中磷酸鹽誘導的礦化[13]。相反，巨噬細胞在清道夫受體的幫助下，可以吞噬氧化型膽固醇并將其分解[14]，逆轉病變過程。由此我們推測，AI組高脂飲食干預同樣誘導兔主動脈瓣膜發生了CAVD樣病理改變，巨噬細胞、炎性因子TNF-α及IL-6在CAVD發展過程中斑塊的形成、VIC向成骨細胞的化生及鈣化的形成三個環節中具有重要意義，而在應用阿托伐他汀藥物干預后，泡沫細胞、炎性因子TNF-α和IL-6的表達以及血脂明顯降低，在一定程度上抑制了CAVD的發展進程。目前CAVD病變的發生機制尚未明確，且用于治療心血管疾病的藥物對其治療效果往往與預期存在差距，因此其治療需要更精確的治療靶點[2]，希望本研究對CAVD機制的認識及探索特異性治療靶點提供依據。

脂質的沉淀及慢性炎癥反應的發生均于病變早期便開始發生，而本實驗中AI組與HC組同時進行，這就意味著他汀干預是在病變初期，甚至是在未發生病變時便進行干預，所以對于已經發生的CAVD病變是否具有同樣治療效果、是否存在逆轉病變的療效還需要進一步認證。此外他汀的抗炎作用具體是通過何種基因表達、信號傳導通路等作用機制問題同樣還需進一步研究明確。

隨著我國醫療水平和生活質量的逐步提高，人口平均壽命不斷延長，鈣化性主動脈瓣疾病已經并且越來越成為威脅人類身體健康的心臟疾病，探索此類疾病的病因對于尋找更加有效的治療策略具有重要的意義[15]。本研究結果顯示他汀對于CAVD病變的治療作用是肯定的，同時希望本研究中提及的炎性因子，可以為進一步探索CAVD特異性治療靶點提供依據。但由于本研究中他汀干預是在實驗早期開始，我們認為他汀干預對CAVD的影響，是自病變發生初期開始的治療作用，而對于已經產生鈣化等中晚期病變是否有逆轉作用，尚待進一步研究。