基于蛋白質組學技術探討小鼠心臟缺血再灌注損傷早期膜蛋白的變化特點

尤宏釗 李玉琳 喬博康 王綠婭 陳博雅 智 瑩 杜 杰

隨著經皮冠狀動脈介入治療技術(percutaneous coronary intervention，PCI)在急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)中的廣泛應用，缺血再灌注損傷(ischemia /reperfusion, I/R)已經成為了患者血運重建過程后最常見的不良事件[1]。目前認為在急性心肌梗死患者血運重建后早期(3d內)是心肌細胞缺血再灌注損傷的重要時間節點[2]。在此期間，炎癥反應和微循環障礙將會造成心肌細胞的進一步凋亡[3]。近些年，研究發現膜蛋白作為蛋白質的重要組成部分，與心臟缺血再灌注損傷早期的病理變化密切相關[4]。因此，探究早期膜蛋白譜的變化對于研究病理機制和篩選潛在的治療靶點具有重要的意義。但目前對于損傷早期心臟組織膜蛋白變化仍缺乏相關研究[5]。蛋白質組學(proteomics)是研究某一類型組織中所有蛋白質組成及其功能。傳統的蛋白質組學研究常采用雙向凝膠電泳圖譜分析(2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D-PAGE)[6]，但是可鑒定的蛋白質數量少且不能精確的定量分析。新近報道的同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術，不僅可以鑒定更多的蛋白質種類，還可以對蛋白質進行高通量的定量分析并已應用于心血管研究[7]。本項研究采用iTRAQ技術對I/R早期心臟組織膜蛋白的表達水平進行了定量分析，結合生物信息學,對I/R早期差異表達的膜蛋白所涉及的生物學進程進行了分析并探討了所涉及的信號通路。

材料與方法

1.動物選擇及分組 健康雄性，C57小鼠，15只，體質量18～20g，由北京安貞醫院動物實驗中心提供。所有小鼠術前均禁食6h。本實驗利用隨機數字表法將15只小鼠分為三組(n=5)：分別為對照組(Sham組)，缺血再灌注1d組(I/R 1d組)，缺血再灌注1d組(I/R 3d組)。

2.材料及試劑 Q-Exactive質譜儀和Easy nLC1000納升級液相色譜儀購自Thermo Finnigan(美國)。膜蛋白純化試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購自ThermoFisher(美國)。胰蛋白酶、SiTRAQ-plex標記試劑盒及緩沖液購自Applied Biosystems(美國)。

3． 心肌缺血再灌注損傷模型的制備 動物模型具體過程如本研究室前文所述[8]。造成心肌缺血后30 min后松開結扎線，分別恢復血流24h和72h。心肌缺血再灌注損傷在體動物模型的制作以心電圖顯示ST段抬高、QRS波變高變寬和心肌顏色由正常顏色變蒼白再變成暗色表示結扎成功實驗過程中動物處置方法符合動物倫理學標準。死亡動物隨時補充。

4．小鼠心臟組織的制備及膜蛋白純化 各組取3只小鼠，Sham組取稱重時刻，I/R組于I/R后1d和3d取小鼠左心室結扎線以下組織，用液氮迅速冰凍并放入-80℃冰箱保存。膜蛋白純化按照ThermoFisher試劑盒說明書進行，并按照前人研究所述進行驗證[9]。

5．酶解及肽段定量標記 各取200μg樣品，分別加入DTT至終濃度為100mM，沸水浴5min，冷卻至室溫。加入200μL UA buffer(8M Urea，150mM TrisHCl pH8.0)混勻，轉入10kd超濾離心管，之后進行梯度離心。各組樣品肽段分別取約100μg,按照AB公司試劑盒:iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進行標記。

6．質譜分析 質譜分析原始數據用軟件Proteome Discoverer1.4進行查庫鑒定及定量分析。采集的質譜數據用Proteome Discoverer 1.4(version1.4.0.288, Thermo Fisher Scientific)進行分析，數據庫為uniprot mouse complete proteome database (Release 2013_06)合并常見污染庫。采用Sequest HT檢索， 檢索的肽段和譜圖匹配(PSM)采用Percolator算法進行過濾，q值<1%(1%的FDR)。檢索后的肽段利用嚴格的最大簡約原則合并成蛋白。

7．生物信息學分析 為了減少物種之間蛋白質的異質性，所有差異蛋白均首先利用Uniprot比對了人和小鼠中表達量的差異(www.uniprot.org)，并經過TMHMM 2.0對差異蛋白的跨膜結構進行了預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。使用AgriGO進行gene ontology(GO)注釋和富集分析。 GO項目描述了蛋白質在三個領域中的作用：生物過程，細胞成分和分子功能。 在注釋和注解增加之后，在“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”(KEGG，http：//www.genome.p/kegg/)中依次將酶映射到注釋序列和代謝途徑[10]。

8．統計學方法 采用 SPSS 21.0軟件分析數據。體重等正態計量資料以均數±標準差表示， 兩組間比較采用t檢驗; 蛋白質表達量等偏態計量資料以中位數和四分位數間距表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義

結 果

1. 缺血再灌注損傷造模及膜蛋白純化的結果 結扎小鼠前降支后，利用心電圖顯示ST段抬高、QRS波變高變寬表示造模成功。首先利用蛋白質印跡分析檢測膜蛋白提取液的純度，發現細胞膜標記(Na +/ K+ATP酶)在膜蛋白溶液的水平遠高于細胞質蛋白的組織。相反，膜蛋白溶液中的細胞質的標記(GAPDH)均低于再灌注損傷和正常心臟組織的細胞質蛋白(圖1)。 這些結果表明膜蛋白成功純化。

圖1 膜蛋白純化的鑒定

2. 蛋白質的鑒定和定量結果 基于iTRAQ的定量蛋白質組學，本研究揭示了缺血再灌注損傷過程中早期差異表達的膜蛋白。利用質譜技術，一共鑒定了23 872種獨特的肽，對應于2 224種蛋白質。其中，預測跨膜域后共鑒定到901個具有跨膜結構的蛋白。比較不同時間點的膜蛋白定量結果，在I/R 1d后/Sham組共鑒定到有895個膜蛋白。在I/R 后3d與/I/R后1d組中鑒定到897個膜蛋白。

3. 缺血再灌注損傷早期不同階段膜蛋白表達譜 為了進一步篩選具有差異的膜蛋白，我們定義兩組之間差異倍數>1.5或者<0.67為差異蛋白，同時還應滿足所選擇肽鏈>1、置信區間>95%[11]。在鑒定到的蛋白中，I-R 1d / Sham組共有211個蛋白上調，有217個蛋白下調；在I/R 3d / I/R 1天組中有205個是上調蛋白，222個是下調蛋白。進一步取差異蛋白的交集，我們發現了兩種膜蛋白的表達譜：154種蛋白在I/R早期1d和3d均持續升高；200種蛋白在I/R早期1d和3d均持續降低，但沒有蛋白在I-R 1d和3d呈現相反的趨勢(圖2)。

4. 差異蛋白的生物信息學分析和涉及的信號通路 為了更好地研究差異蛋白地總體趨勢和功能學分類，我們采用Gene Ontology(GO)對不同階段差異表達的全部501個蛋白進行了富集分析。差異蛋白的GO分析被分為了生物過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF)三部分組成，主要結果呈現在圖3。

圖2 缺血再灌注損傷差異蛋白的分布

在生物過程中，I/R后1d與Sham相比，差異表達的膜蛋白中主要涉及氧化應激，能量代謝、電子傳遞鏈(圖3A)；I/R后3d與I/R后1d相比，差異表達的膜蛋白中主要涉及氧化還原、能量代謝途徑以及電子傳遞鏈(圖3B)。在細胞成分上，由于進行了膜蛋白純化，差異表達的蛋白主要集中在膜結構、細胞外泌體和線粒體等具有細胞膜結構的細胞成分(圖3C，D)。在分子功能上，I/R后1d與Sham相比，差異表達的膜蛋白中主要涉及離子結合，核苷酸結合和通道蛋白(圖3E)。I/R后3d與I/R后1d相比，差異表達的膜蛋白中差異表達的膜蛋白中主要涉及離子結合，骨架蛋白和轉運蛋白(圖3F)。離子結合包括了陽離子結合、金屬離子結合等。

圖3 缺血再灌注損傷早期差異表達膜蛋白的生物信息學分析 A:I/R1天的生物進程分析；B:I/R3天的生物進程分析; C:I/R1天的細胞成分預測；D:I/R3天的細胞成分預測;E:I/R1天的分子功能預測；F:I/R3天的分子功能預測

5. 差異蛋白所涉及信號通路的探究 為了探究差異膜蛋白所涉及的信號通路，我們采用KEGG分析對差異蛋白進行了鑒定。I/R后1d和3d的心臟組織膜蛋白主要涉及信號通路主要是氧化磷酸化、糖代謝、脂代謝心肌收縮。

圖4 缺血再灌注損傷早期差異表達膜蛋白的通路 A:I/R 1d的信號通路分析；B:I/R 3d的信號通路分析

討 論

缺血再灌注損傷是急性心肌梗死患者最常見的不良事件。了解心肌缺血再灌注過程中的蛋白質合成與調控對研究疾病的發病機制和治療靶點具有重要的意義。有關缺血再灌注損傷的研究多數集中于探究差異表達蛋白質在疾病中起到的作用，很少有研究關注早期蛋白譜的變化。以前的研究表明，缺血再灌注損傷早期是損傷發生的關鍵階段。在這個階段，心肌細胞凋亡和微循環障礙作為缺血再灌損傷早期的重要病理特征同時發生[12-13]。其中，膜蛋白都起到了重要的作用[14]。為了更好的理解缺血再灌注損傷早期所涉及的膜蛋白變化，我們基于iTRAQ首次定量檢測了I/R早期差異表達的膜蛋白, 結合生物信息學和公共數據庫，描繪了差異膜蛋白譜，也發現其中主要涉及的病理過程是氧化應激和能量代謝。

1.膜蛋白和氧化應激 以前的研究已經發現,氧化應激是缺血再灌注損傷早期的重要病理生理過程[15]。膜蛋白作為重要的信號受體，不僅可通過激活下游通路調節調控病理過程，此外部分細胞膜降解產物具有很強的炎性趨化作用，使微循環中的白細胞大量增加，加重了微循環障礙。S1PR1作為信號分子受體，激活后可以減少心肌心肌細胞的氧自由基的形成，從而達到抗氧化的作用[16]。TLR3是TLR樣受體中重要的成員,主要分布在細胞的內涵體上。其他TLRs信號轉導通路不同,TLR3識別配體后通過含有TRIF結構域的轉接蛋白參與調控了I-R損傷后細胞的氧化應激[17]。除了細胞表面的膜蛋白以外，線粒體的膜蛋白也被認為與缺血再灌注損傷有關。例如Ca2+攝取蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)是線粒體的內膜蛋白,可以調節Ca2+轉運,防止線粒體內出現Ca2+超載發生。氧化應激可引起MICU1變構，使鈣離子內流增加，造成鈣超載，從而可導致并促進細胞的不可逆性損傷[18]。盡管目前減少氧化應激帶來的心肌損傷已經作為治療心臟缺血再灌注損傷的重要干預手段，但是新型藥物的臨床治療效果欠佳[19]，更有針對性的治療靶點有待發現。既往的蛋白芯片研究對于發現新的治療靶點所提供的研究價值有限，而本項研究的結果為尋找新的分子靶標提供了更為直接的組學依據。

2.膜蛋白和能量代謝 能量代謝是心臟缺血再灌注損傷的始動因素。相關研究發現能量代謝障礙發生后心肌細胞的基因結構及表達均受到影響，且心肌細胞內ATP水平與心肌細胞的凋亡、壞死密切相關[20]。由于再灌注損傷期間，線粒體的結構、功能因缺血遭到嚴重破壞，不能進行有效的有氧氧化產能，導致恢復再灌注的相當一段時間內能量來源仍然主要依靠糖酵解。我們的實驗結果表明再灌注早期，與三羧酸循環相關的膜蛋白表達下調，但氧化磷酸化的膜蛋白表達量卻增強，這點與前人的研究相一致。GLUT4不僅參與糖代謝、脂肪酸代謝，在缺血再灌注損傷中也起到重要作用。脂肪酸的轉運、貯存和利用都有賴于膜蛋白的參與[21-22]。前人的研究發現，心肌細胞脂肪酸氧化向糖酵解轉變，而使得心肌內脂質的聚集和利用減少[23]，這也解釋了我們的結果中第1天和第3天脂代謝整體水平持續下降的原因。另外，氧自由基引起的過氧化反應對膜磷脂造成了損傷，造成線粒體的電子傳遞鏈也受到了影響。前人研究認為雖然再灌注損傷后電子傳遞鏈整體的表達水平是上升的，但是復合物I-III的結構卻出現了損傷[24]。我們的結果從蛋白水平印證了前人的結果，但是電子傳遞鏈各復合體作用于缺血再灌注損傷的機制，仍有待于進一步的研究，特別是蛋白質絕對定量的結果。

我們的研究首次利用相對定量的方法，探究了與正常心臟相比，I/R 1d后和3d膜蛋白的差異，并結合生物信息學，對差異膜蛋白進行了GO分析和通路分析，為探究膜蛋白在缺血再灌注損傷早期的作用及尋找潛在的治療靶點提供了可靠的組學結果。盡管如此，本項研究仍存在兩點局限，一是iTRAQ實驗過程中大量共洗脫肽段對定量準確性有一定影響，同時由于缺少內標，差異蛋白的鑒定是相對定量的結果，對于每一種差異蛋白仍需要進一步絕對定量的結果。二是盡管我們對于每一個差異蛋白也用公共數據庫進行了比對人和鼠之間的差異，但仍不能完全消除可能受不同物種間異質性的影響。

綜上所述，定量蛋白質組學技術可有效地用于組織蛋白鑒定和相對定量，利于更好地了解膜蛋白與心臟缺血再灌注損傷早期病理變化的關系。本項研究的結果為探究缺血再灌注損傷早期心臟組織膜蛋白所涉及的病理過程和潛在的治療靶點提供了新的觀點和證據。