β3腎上腺素受體激動劑米拉貝隆對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

劉夢如 王 悅 王 越 楊 敏 卜 軍 吳小凡

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, As)是冠心病和腦卒中發生的首要原因。As具有典型的炎癥變性、滲出及增生特點，在斑塊破裂處常有巨噬細胞的浸潤、平滑肌細胞增生及多種炎性因子的表達升高。因此減輕病變炎癥反應，延緩As進展成為了近年研究熱點。既往研究證實，β3腎上腺素能受體(β3 adrenergic receptors, β3AR)是心血管功能的重要調節因子，其主要在心肌細胞、血管內皮細胞與脂肪細胞中表達[1]。β3AR激活后可通過促進血管舒張、改善脂質代謝、防御氧化應激及炎癥反應損傷等多重機制起到重要的心血管保護作用[2]。米拉貝隆是高選擇性的β3AR激動劑，因其舒張膀胱逼尿肌的功能已被批準用于膀胱過度活動癥的治療[3]。新近隨機對照研究發現，米拉貝隆可改善心力衰竭患者的左心室射血分數，其主要機制為有效抑制了心肌組織氧化應激及炎癥反應[4]。然而，米拉貝隆是否具有延緩As的作用尚不明確。本研究通過構建載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠As模型，觀察米拉貝隆干預對As斑塊進展的影響。

材料與方法

1.材料與試劑 無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級ApoE-/-小鼠及高脂飼料(含21%脂肪，0.15%膽固醇)購自北京華阜康生物科技股份有限公司；米拉貝隆購自Med Chem Express公司；油紅O 染色液購于美國Sigma公司；HE染液購于碧云天公司；Masson三色染液試劑盒購于Leagene公司；CD68、α-SMA抗體購于美國Abcam公司。

2.實驗方法 (1)動物分組及模型建立：SPF級,8周齡,雄性,ApoE-/-小鼠16只，在首都醫科大學附屬北京安貞醫院動物實驗中心適應性喂養1周后開始實驗。給予ApoE-/-小鼠高脂飲食16周，建立As模型。隨機分為米拉貝隆組(8只，每天10mg/kg，灌胃)和安慰劑組(8只，每天等量1%DMSO的0.9%氯化鈉液，灌胃)；另設C57BL/6J 8周齡雄性小鼠空白對照組(8只，每天等量1%DMSO的0.9%氯化鈉液，灌胃)，6周后處死取材。

(2)標本采集與處理 取材前夜禁食水，次日處死后剖開胸腔，體視顯微鏡下剝離主動脈。分離小鼠心臟，將心臟基底部以4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋。于主動脈3個瓣葉水平，將組織塊切為5um厚的連續石蠟切片。

(3) ApoE-/-小鼠主動脈斑塊表面積及橫截面積測定 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部石蠟切片進行油紅O染色及HE染色。照相后用NIS-ELEMENT軟件測定As斑塊表面積與動脈壁表面積，計算As斑塊表面積與動脈壁表面積的百分比。

(4) ApoE-/-小鼠As斑塊成分測定 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部石蠟切片進行Masson三色染色、抗CD68和抗α-SMA免疫組織化學染色。顯微鏡下照相，利用NIS-ELEMENT軟件，計算Masson染色下膠原纖維面積與動脈管壁面積百分比；計算抗CD68和抗α-SMA染色下，陽性染色面積與動脈管壁面積百分比，分別反映As斑塊中巨噬細胞及平滑肌細胞的數目。

3.統計學方法 采用GraphPad Prism7.0圖像軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA), 符合正態分布的兩組數據間比較用SNK法檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1．米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主As斑塊面積的影響 安慰劑組小鼠較空白對照組相比主動脈斑塊表面積(P<0.05)及橫截面積(P<0.05)顯著增大。與安慰劑組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈斑塊表面積(P<0.05)及橫截面積(P<0.05)顯著減少(表1，圖1)。

表1 米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的影響

注:與對照組比較，aP<0.05；與安慰劑組比較，bP<0.05

圖1 各組小鼠斑塊面積變化A：油紅O染色示各組小鼠主動脈斑塊表面積(n=3)；B：各組小鼠斑塊表面積占動脈壁表面積的百分比；C：蘇木精伊紅染色示各組小鼠斑塊橫截面積(40x，n=8)；D：各組小鼠斑塊橫截面積占血管管腔的百分比。1：空白對照組；2： 安慰劑組；3：米拉貝隆組。注:兩兩比較,*P<0.05

圖2 各組小鼠斑塊成分變化A：CD68免疫組織化學染色示各組小鼠主動脈斑塊巨噬細胞浸潤(400x，n=8)；B：各組小鼠斑塊CD68陽性面積占動脈壁總面積的百分比；C：α-SMA免疫組化染色示各組小鼠主動脈斑塊平滑肌增殖(400x，n=8)；D：各組小鼠斑塊α-SMA陽性面積占動脈壁總面積的百分比。E：Masson染色示各組小鼠主動脈斑塊膠原纖維(200x，n=8)；F：各組小鼠斑塊膠原纖維面積占動脈壁總面積的百分比。1：對照組；2：安 慰劑組；3：米拉貝隆組。注：兩兩比較，*P<0.05

2. 米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主As斑塊成分的影響 與空白對照組比較，安慰劑組小鼠主動脈斑塊中膠原纖維面積(P<0.05)，巨噬細胞(P<0.05)及平滑肌細胞(P<0.05)數目均顯著增多。與安慰劑組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈斑塊中膠原纖維面積(P<0.05)，巨噬細胞(P<0.05)、平滑肌細胞(P<0.05)數目顯著減少。與空白對照組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈斑塊中膠原纖維面積及平滑肌細胞數目增多，但差異均無統計學意義(表2，圖2)。

討 論

我們的研究發現，米拉貝隆可減小ApoE-/-小鼠主動脈硬化斑塊表面積及橫截面積，減少As斑塊中巨噬細胞、平滑肌細胞數目及膠原纖維，提示米拉貝隆具有延緩As進展的作用。

表2 米拉貝隆對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊成分的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與安慰劑組比較，bP<0.05

β腎上腺素能受體廣泛表達于心臟及血管組織中[1]，β1與β2AR激活可調節心肌收縮及血管平滑肌松弛，而β3AR激活則具有調節糖脂代謝，抑制氧化應激、炎癥反應的作用。既往有研究表明在給予ApoE-/-小鼠β3AR激動劑BRL37344干預后，其主動脈硬化斑塊面積明顯縮小[5]；Berbée等[6]還發現, 激活β3AR可加快ApoE-/-小鼠和Ldlr-/-小鼠的脂質降解，顯著減少血清LDL-C的表達。以上研究均提示β3AR激活后具有抗As作用。

米拉貝隆是一種高選擇性、高效能的β3AR激動劑，因其激動β3AR后促進膀胱逼尿肌松弛并增加肌肉穩定性而作為治療膀胱過度活動癥的臨床用藥，在相關的臨床研究中已經證實米拉貝隆具有良好的安全性和耐受性[3]。近年來，隨著β3AR在心血管疾病病理進程中的重要作用逐漸被發現[7]，米拉貝隆對心血管疾病的治療作用逐漸成為研究熱點Bundgaard等[4]通過隨機對照研究揭示, 米拉貝隆能提高慢性心力衰竭患者的左心室射血分數，但目前米拉貝隆對As的作用尚不明確，因此，本研究以米拉貝隆干預ApoE-/-小鼠，觀察As的進展情況，結果顯示，與安慰劑組比較，米拉貝隆組小鼠主動脈硬化斑塊表面積與橫截面積均顯著減小，提示米拉貝隆可延緩ApoE-/-小鼠As病程的發展。

As是一種慢性炎癥性疾病，血管內皮損傷后，單核細胞遷移進入動脈內膜分化為巨噬細胞以及平滑肌細胞過度增生是As的重要病理生理過程[8]。斑塊周圍浸潤的巨噬細胞可分泌炎癥因子，促進炎癥反應，加重斑塊的不穩定性[9-10]；炎癥反應加重可導致血管內皮細胞壞死，引起細胞外基質增多沉積，導致動脈血管纖維化加重，加速As的病程發展[11]，因此，抑制炎癥反應，減少巨噬細胞、平滑肌細胞浸潤及纖維化，可作為延緩As發展的有效治療手段。我們的研究表明，與安慰劑組相比，米拉貝隆組小鼠As斑塊中巨噬細胞、平滑肌細胞和膠原纖維等成分的表達均明顯降低。更值得注意的是，與空白對照組相比，米拉貝隆組小鼠管壁平滑肌細胞和膠原纖維的數量有所增加，但差異不具有統計學意義，提示米拉貝隆在減弱斑塊周圍炎癥反應、減少平滑肌細胞浸潤和血管纖維化中可能發揮重要作用，這可能是其延緩As發展的重要原因。

綜上所述，本研究的結果提示米拉貝隆可能通過減少As斑塊中的巨噬細胞、平滑肌細胞浸潤及膠原纖維成分而減緩As的進展。提示了米拉貝隆在As的防治方面具有良好的臨床應用前景。米拉貝隆是否也通過血脂代謝和氧化應激等途徑影響As仍需要在未來的研究中進一步探索，其作為抗As藥物走上臨床應用也仍存在很多問題值得進一步研究。