血小板鈣庫操縱性鈣通道蛋白與冠狀動脈斑塊易損性的相關性研究

袁楚婷 葛長江 宋現濤 張 閩 苑 飛 許 鋒

冠狀動脈粥樣硬化易損斑塊是導致急性冠狀動脈事件的重要因素。冠狀動脈造影是臨床診斷冠心病的金標準，但其只能評估冠狀動脈管腔的狹窄程度，且對于血管狹窄程度的判定會受到術者的主觀影響。血管內超聲(intravenous ultrasound,IVUS)不僅可以測量血管外彈力膜面積、管腔面積、斑塊面積、纖維帽厚度，還可以判斷斑塊性質，并通過上述測得的相關數據進一步計算斑塊負荷、偏心指數、重構指數等重要參數，對斑塊進行精確分析，因此對于冠狀動脈易損斑塊的評估具有很高的臨床價值。

血小板的活化在冠狀動脈易損斑塊的形成及發展中發揮重要作用，而鈣庫操縱性鈣通道(store operated calcium channel, SOCC)則在血小板活化過程中發揮重要作用。本研究以冠狀動脈易損斑塊這一引致急性冠狀動脈綜合征的主要因素為切入點，通過IVUS測定相關指標判斷斑塊易損性，結合血小板SOCC在不同階段的變化水平，深入探討血小板鈣庫操縱性鈣通道蛋白與冠狀動脈斑塊易損性的相關性。

資料與方法

1.一般資料 入選2015年1月1日至2016年8月31日,在北京安貞醫院住院行冠狀動脈造影確診為單支單處冠狀動脈臨界病變的患者118例，經冠狀動脈血管內超聲(美國波士頓科學)分析斑塊性質，分為穩定斑塊組(SP組，n=76)和易損斑塊組(VP組，n=42)。采集血液標本并應用流式細胞學檢測法測定血小板鈣離子信號蛋白STIM1、Orai1、TRPC1水平，然后對VP組行介入治療，SP組予改善生活方式、控制危險因素以及阿司匹林、硝酸酯類、β受體阻滯劑及他汀類等冠心病二級預防用藥保守治療。1年后對SP組患者復查IVUS，根據斑塊性質變化分別分為進展為易損斑塊組(SVP組，n=16)和未進展為易損斑塊組(SSP組，n=60)，并復測血小板鈣離子信號蛋白水平。

排除標準：既往行經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)或冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting,CABG)者；任意一處冠狀動脈狹窄>75%或復雜冠狀動脈病變者；心功能NYHA分級II級以上或心源性休克者；合并嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、感染性疾病者。

2.血小板SOCC含量測定 流式細胞學方法測定血小板STIMI1、Orail、TRPC1蛋白含量：EDTA抗凝全血-CD61標記血小板-PBS液固定-羊血清封閉Fc受體、減少一抗非特異性結合-抗STIMI1、Orail、TRPC1單克隆抗體與靶蛋白結合-FITC熒光標記-PBS液固定-流式細胞儀測定SOCC蛋白表達。

3.冠狀動脈造影及IVUS指標測量(1)冠狀動脈造影檢查：經橈/股動脈入路行冠狀動脈造影術，取至少2個以上能夠充分暴露病變并相互垂直的投照體位判斷冠狀動脈狹窄程度。

(2)IVUS測定：使用Boston公司i Lab超聲診斷儀及 Atlantis SR Pro冠狀動脈超聲成像導管，血管內超聲探頭為 2.9 F，頻率40 MHz。IVUS檢查前予普通肝素3 000～5 000 U，并向靶血管內注射硝酸甘油100～300μg，排除超聲導管保護鞘內空氣，經0.014英寸的導引導絲將超聲導管送至靶病變遠端10mm處，以0.5 mm/s速度自動回撤 IVUS 導管采集冠狀動脈內超聲影像，直至導管探頭至左主干或右冠開口。測量病變處血管外彈力膜面積(external elastic membranous area，EEMA)、最小管腔面積(minimum luminal area，MLA)以及參考血管外彈力膜面積(目標病變近、遠端10mm處)，計算斑塊面積(plaque area，PA=EEMA-LA)、斑塊負荷(plaque burden，PB=PA/EEMA×100%)、偏心指數(eccentric index，EI=斑塊最厚處厚度-同一截面斑塊最薄處厚度/斑塊最厚處厚度，EI>0.5為偏心性斑塊、EI<0.5為向心性斑塊)、重構指數(remodeling index，RI=EEMA/近遠端參考血管面積平均值，RI>1.05為正性重構、RI<0.95為負性重構)，通過比較斑塊內與血管外膜回聲分析斑塊性質(分為脂質斑塊、纖維斑塊、鈣化斑塊、混合斑塊)。所有血管段定量測定均選擇最狹窄血管橫截面于心臟舒張末期進行分析。

(3)易損斑塊的IVUS特征：①纖維帽厚度<0.7mm；②脂質核心面積>1.0mm2；③脂質核心占斑塊面積>20%；④偏心斑塊；⑤斑塊內無回聲。

冠狀動脈造影結果及IVUS圖像分析由2名經驗豐富的心內科介入醫師在不了解患者臨床和生化結果的情況下進行分析。

4.統計學方法 采用SPSS 15.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以百分比表示，使用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

表3 兩組IVUS相關指標比較

注：兩組間比較，aP<0.05,bP<0.01

表5 SVP組與SSP組IVUS相關指標比較

結 果

1.研究對象的一般情況 VP組和SP組兩組間在性別、年齡、吸煙史、體質量指數、血壓、血脂、空腹血糖、血肌酐，既往高血壓、糖尿病及高脂血癥病史等基線資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組患者一般資料

2.治療前組研究人群的3種SOCC水平比較 VP組血小板STIM1、Orai1、TRPC1水平明顯高于SP組(P<0.05，表2)。VP組與SP組IVUS相關指標比較見表3。

表2 治療前兩組患者3種SOCC水平比較

注：兩組間比較，aP<0.05,bP<0.01

3.1年后SP組內3種SOCC變化情況 1年后對SP組患者復查IVUS，其中16例進展為VP(SVP組)，剩余60例仍為SP(SSP組)。SVP組血小板STIM1、Orai1、TRPC1水平明顯高于SSP組(P<0.05)，SSP組SOCC水平較治療前有下降趨勢，但無統計學意義(P>0.05，表4)。SVP組與SSP組IVUS相關指標比較見表5。

表4 1年后兩組3種SOCC水平比較

注：兩組間比較，aP<0.05,bP<0.01

討 論

急性冠狀動脈綜合征是目前中國成人心臟病住院和死亡的第一位殺手，而冠狀動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性是引致急性冠狀動脈綜合征的主要原因。研究發現，近70%的急性冠狀動脈事件并非由冠狀動脈嚴重狹窄引起，而是由冠狀動脈易損斑塊(vulnerable plaque)破裂誘發血栓形成所致的急性閉塞所致[1]。而易損斑塊的冠狀動脈造影特征大部分表現為臨界病變。冠狀動脈臨界病變(borderline lesion)是指以冠狀動脈造影直徑法測定狹窄程度為50%～70%的病變，又稱為“中等程度狹窄”。

長期以來，冠狀動脈造影一直被認為是診斷冠狀動脈病變、判定狹窄程度和介入指征的“金標準”，但冠狀動脈造影僅能顯示被造影劑充填的管腔輪廓，無法判斷局部血管壁的病理結構改變和冠狀動脈粥樣硬化斑塊的性質，在評價冠狀動脈病變方面存在不可避免的缺陷[2]。而IVUS具有良好的血管穿透性，不僅能夠觀察管腔形態，還可顯示血管壁的詳細結構及粥樣硬化斑塊的形態特征，對病變進行精確的定量分析，對于臨界病變的評估具有一定意義[3]。

“易損斑塊”的概念是由Muller等[4]于1989年提出的，是指冠狀動脈內非阻塞性粥樣硬化斑塊，性質不穩定，具有破裂傾向。Naghavi等[5]歸納了易損斑塊的主要組織病理學特征，包括大的脂質核心和薄的纖維帽，同時伴隨大量炎癥因子的浸潤。另外，斑塊形態學呈明顯偏心性、管腔狹窄、管腔的代償性擴張即正性重構等也被認為是易損斑塊的重要組織病理學特征[6]。IVUS判斷易損斑塊參考參數為：斑塊內脂核的面積>1mm2，脂核占斑塊面積比>20%，斑塊的纖維帽厚度<0.7mm[7]。

IVUS的原理是利用高頻超聲波，在血管內呈現高分辨率的影像，可以全面分析血管壁和管腔的情況，被認為是診斷冠心病的新的“金標準”。彩色編碼的虛擬組織超聲(IVUS-VH)克服了普通血管內超聲空間分辨率低的缺點，可以區分血栓、脂核、纖維、鈣化等不同成分。近年來興起的超聲彈性成像技術根據不同組織在受到外力壓迫后發生變形的程度，將受壓前后回聲信號移動幅度的變化轉化為實時彩色圖像，可以直觀評估冠狀動脈斑塊易損性[8]。

在易損斑塊破裂誘發血栓形成的過程中，血小板的活化和聚集起到至關重要的作用。已知動脈粥樣硬化進程中凋亡的血管平滑肌細胞是很強的血小板激活劑，同時還可以促進凝血酶的生成[9]，而凝血酶是血小板最強的激活劑，活化的血小板聚集在富含凋亡細胞的區域，激活后可浸潤動脈粥樣硬化斑塊，其釋放的金屬基質蛋白酶可分解斑塊中的纖維成分，使纖維帽變薄，從而引起斑塊破裂[10]。

血小板的活化是一個非常復雜的生物學現象，鈣離子作為胞內第二信使偶聯信號傳導，廣泛參與調節大多數的細胞活動，包括血小板活化。鈣離子信號通過胞內鈣離子濃度的升高和降低來實現血小板的生物學功能。血小板胞漿內鈣離子濃度的升高是血小板活化的標志，也是血小板活化的始動因素之一，并且全程參與到血小板活化、粘附、聚集以及血栓形成過程中[11]。

細胞內鈣離子濃度的上升，除了細胞內鈣池鈣離子釋放外，還依賴于細胞外基質中鈣離子的跨膜內流。SOCC是非興奮性細胞胞外Ca2+內流的主要通道，參與了基因轉錄、細胞凋亡、肌肉收縮、炎癥和應激等多種生理和病理生理過程。有研究表明Orai 1和 STIM 1兩種蛋白是構成SOCE通道的重要組成部分。Orai是近年來發現的一種位于細胞膜上的4次跨膜離子通道蛋白，哺乳動物Orai家族蛋白Orai 1-3主要參與SOCC鈣內流孔道的構成，其中Orai 1是最重要的SOCE效應蛋白。而 STIM 家族蛋白STIM 1-2 主要作為胞內鈣庫鈣離子濃度的“傳感器”，在鈣離子濃度下降時將這一信號傳遞到胞膜的SOCC，促使其開放，介導鈣離子內流。在哺乳動物研究中發現STIM1 是 SOCC 的重要調節分子，而 STIM2 主要與維持鈣庫的穩定有關。STIM1 具有感受鈣池充盈狀態并將感受信號通過不同蛋白作用機制傳遞給Orai及TRPC通道的雙重功能，是共同介導SOCE的關鍵分子[12-14]。

同理，SOCC作為血小板基質中鈣離子內流的主要通道，其本身在血小板活化、血栓形成過程中地位非常重要。血小板中主要有兩種鈣池，其中最主要的鈣池稱為密管系統(dense tubular system，DTS)，類似于其他類型細胞的內質網。另一個鈣池是溶酶體樣酸性細胞器(lysosome-like acidic organelles，LLAO)。受血小板內兩個鈣池性質、特點各不相同的影響，與每個鈣池對應的SOCC亦發揮獨立的鈣內流效應[15]。相似的是，兩個不同的鈣池質膜上都表達有STIM1蛋白分子[16]，作為鈣池上的鈣離子傳感器，STIM1負責大部分血小板基質中游離鈣離子的內流，其聯合血小板質膜上跨膜蛋白Orai1共同調解，對鈣庫釋放鈣離子升高胞質內鈣離子濃度的作用發揮放大效應[17-18]。國外有研究發現，凝血酶激活血小板可以使Orai1蛋白表達上調[19]，血小板活化后可促進更多凝血酶生成，使這一過程呈正反饋。而STIM1、Orai1及TRPC1在凝血誘導的血小板聚集中發揮重要作用[20]。

本研究結果表明，血小板STIM1、Orai1、TRPC1蛋白的表達水平與冠狀動脈粥樣硬化易損斑塊之間存在明顯相關性，即根據血小板SOCC表達水平預測斑塊易損性與IVUS判斷結果一致。因IVUS費用昂貴、技術難度大、受病變條件限制等，其臨床應用存在一定的局限性，而通過測定血小板SOCC表達水平預測易損斑塊則更易于在臨床推廣，但目前血小板SOCC測定條件復雜、技術要求較高，若能進一步簡化SOCC測定流程，未來有望成為預測急性冠狀動脈事件的臨床檢測指標。本研究尚存在一定的局限性，未來可在此基礎上進行更深入的研究，進一步探索易損斑塊的病理機制，建立簡便、準確的診斷技術，篩選安全、可靠的治療方法，實現易損斑塊的早期識別，最終降低急性心血管事件的發生率和死亡率。