成纖維細胞特異敲除轉錄因子ATF3基因的小鼠模型構建

陳博雅 張聰聰 李玉琳 王綠婭 杜 杰

心臟成纖維細胞過度分泌細胞外基質蛋白在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中非常重要[1]。成纖維細胞和心臟損傷后的炎癥啟動關系密切[2]。但目前對心臟成纖維細胞的了解甚少; 轉錄因子ATF3(activating transcription factor 3)參與調控心臟后負荷增大引起的心肌細胞肥大和心臟肥厚[3]，參與調控脂質沉積導致的血管細胞凋亡和炎癥浸潤[4]。ATF3在穩(wěn)態(tài)下低表達，但多種刺激可誘導ATF3表達快速升高。ATF3既可促進又可抑制基因轉錄取決于其細胞來源及所受刺激[5]。ATF3全敲除不便于揭示ATF3在心血管疾病中功能，為此，本研究擬運用Cre /loxP重組酶系統(tǒng)構建成纖維細胞特異性敲除ATF3小鼠，為進一步研究ATF3在心血管疾病中作用及機制提供條件。

材料與方法

1.儀器和試劑 冰凍切片機(德國Leica公司)，激光共聚焦顯微鏡(TCS 4D; Leica)，NIS-Elements 定量分析軟件，DNA凝膠電泳。他莫昔芬(美國Sigma公司)，鼠尾消化液DirectPCR(美國VIAGEN公司)， ATF3抗體(美國sigma公司)，Vimentin抗體(英國abcam公司)，CD-45抗體、CD31抗體、PDGFRα抗體(BD生物)，反轉錄試劑盒(美國promega公司), SYBR 聚合酶鏈反應(PCR)混合物(日本TaKaRa公司)。

2.實驗動物及分組 成纖維細胞標志基因Col1a2攜帶雌激素受體驅動的Cre小鼠(Col1a2-ERCre)小鼠購自美國Jackson實驗室; ATF3fl/fl小鼠由本課題組構建，均為 C57BL/6J 品系。實驗小鼠均在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，清潔飲食，溫濕度適宜。12只敲除小鼠和12只同窩野生型小鼠各分為心臟I/R組和假手術組，分選心臟成纖維細胞檢測ATF3基因表達。4只敲除小鼠和4只同窩野生型小鼠復制I/R模型，免疫熒光定位觀察心臟ATF3蛋白表達。本實驗得到北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準。

3.條件性敲除小鼠構建 利用胚胎顯微注射法在小鼠ATF3基因第3號和第4號外顯子之間插入loxP位點，得到ATF3wt/fl小鼠，將其F0代成年鼠與攜帶成纖維細胞特異表達Cre酶的Col1a2-ERCre小鼠交配，得到的是F1代Col1a2-ERCre/ ATF3wt/fl小鼠，F(xiàn)1代之間交配，得到Col1a2-ERCre/ ATF3fl/fl小鼠，小鼠給予他莫昔芬腹腔注射，ATF3基因被切掉，對照組為Col1a2-ERCre/ ATF3wt/wt。如圖1。

圖1 小鼠制作過程示意圖

4. 小鼠基因型鑒定 將雜交后3周齡子代小鼠剪下鼠尾，加入蛋白酶K和鼠尾裂解液1∶100比例的混合液100ul，56℃水浴過夜，85℃40min水浴變性, 提取DNA進行PCR擴增，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定小鼠基因型。PCR擴增引物分別為：ATF3fl/fl上游5’-ACTTAAGTCGTGAGGCTGGAGATGG-3’，下游5’-A AACCAGAGGAGAGTGTTGGATGGA-3’；Col1a2-ERCre上游 5’-CCTGATCCT GGCAATTTCGGCTA-3’，下游5’-TCCAATTTACTGACCGTACACC AA-3’。

5. 他莫昔芬誘導基因條件性敲除 給予8周齡的小鼠腹腔注射他莫昔芬(食用油溶解)，劑量為0.8mg.g-1.d-1，共注射5d，可將雌激素受體的配體結合區(qū)與Cre重組酶融合產生嵌合重組酶，使其進入核內發(fā)揮作用，敲除ATF3基因。

6.小鼠心臟I/R模型建立 采用本實驗室建立模型的方法[6-7]，異氟烷誘導麻醉后維持麻醉，仰臥固定四肢，以左胸心尖搏動最明顯處為突破點，將心臟輕輕從開口擠出來，用 7-0 絲線結扎左冠狀動脈前降支，將心臟立即放入胸腔內，縫合皮膚，30min后將結扎線松開。

7.心臟成纖維細胞分選 I/R手術后2h，1%戊巴比妥麻醉小鼠，0.9%氯化鈉注射液灌洗心臟后取下心臟組織，利用Ⅱ型膠原酶 37°消化獲得單細胞懸液。加入抗體anti-CD45, anti-CD31，anti-PDGFRα,室溫避光孵育 30 min，加入2mL含有3%FBS的PBS溶液終止孵育，1 500r/min，離心5min，棄掉上清液，1mL含有3%FBS的PBS重懸，濾網過濾，待上機。

8. ATF3基因mRNA水平檢測 心臟組織用Trizol試劑盒提取RNA, 使用Nanodrop 2000儀器測定RNA濃度，采用反轉錄試劑盒得到cDNA, PCR檢測目的基因ATF3的表達量，引物設計采用Primer 5.1軟件，由北京諾賽生物科技有限公司合成，引物如下:ATF3：上游 5’-CATCCTTTGTCTCACCGGCT- 3’，下游 5’CCC ATTAGTGCGATCCTGCT-3’；GAPDH：上游5’-G CATCTTCTTGT GCAGTGCC-3’，下游 5’-GAGAAGGCAGCCCTGGTAAC-3’。

9.心臟成纖維細胞ATF3蛋白表達 Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl以及Col1a2-ERCre/ ATF3wt/wt小鼠I/R術后6h，麻醉后取心臟組織制成冰凍切片，加入ATF3及成纖維細胞標志抗體(vimentin), 4℃,過夜，熒光二抗顯色，進行免疫熒光共定位。激光共聚焦顯微鏡采圖。

圖4 免疫熒光檢測ATF3蛋白表達量 A:Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt；B:Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl注：箭頭表示ATF3在成纖維細胞定位情況, 標尺為10μm

10.統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. ATF3成纖維細胞特異性敲除小鼠基因鑒定 剪取3周齡小鼠的鼠尾，進行小鼠基因型鑒定，如圖2A，小鼠Col1a2-ERCre基因型為陽性, 條帶為～500bp, ATF3 loxP的基因型為純合陽性, 條帶為210bp。結果表明Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl小鼠構建成功。

圖2 雜交小鼠子代基因型鑒定 A:Col1a2-ERCre基因的目的條帶；B:ATF3 loxP基因的目的 條帶

圖3 熒光定量PCR檢測ATF3 基因表達量 注：兩組 相比，***P<0.001

2.PCR檢測小鼠心臟成纖維細胞ATF3表達的結果 基礎狀態(tài)下ATF3表達量很低，與假手術組相比，術后Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt組ATF3明顯上調[(0.02534±0.002654)vs. (0.5982±0.03495)，P<0.0001]，與術后Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt組相比，術后Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl組表達量仍然很低[(0.5982+0.03495)vs. (0.06456+0.005704)，P<0.0001]。結果提示ATF3成纖維細胞特異敲除成功。

3.免疫熒光觀察小鼠心臟成纖維細胞ATF3表達的結果 為了進一步驗證特異性敲除小鼠構建成功，我們用免疫熒光共定位的方法檢測成纖維細胞中ATF3的表達。缺血再灌注術后，Col1a2-ERCre/ATF3wt/wt小鼠心臟成纖維細胞表達ATF3，而Col1a2-ERCre/ATF3fl/fl小鼠心臟成纖維細胞ATF3基本不表達。結果表明，ATF3成纖維細胞特異敲除成功。

討 論

缺血性心臟病是發(fā)病率高，危急生命的重大疾病，病理過程包括心肌細胞的死亡，炎癥細胞的浸潤[8]，成纖維細胞的增殖及纖維瘢痕形成，嚴重者最終導致心力衰竭，病理改變包括間質纖維化，房室重塑和心室順應性降低[9]。以往研究主要報道這一過程中心肌細胞的損傷，作為間質中數(shù)量最多的成纖維細胞，也在疾病的病理過程中發(fā)揮重要的作用。幾乎所有心臟病都涉及以心臟成纖維細胞過度沉積細胞外基質蛋白為特征的病理性心肌重構，降低心室順應性最終導致心力衰竭[10]。成纖維細胞是數(shù)量最多的間質細胞，位于心肌間質，心外膜和血管周圍區(qū)域。成纖維細胞作為心肌細胞的結構支架，在正常狀態(tài)下維持細胞外基質蛋白的穩(wěn)態(tài)，一旦受到病理性刺激，便由成纖維細胞轉化為其活化形式，即肌成纖維細胞，其分泌細胞外基質促進纖維化[11]。已有報道，成纖維細胞參與細胞的凋亡，炎癥浸潤，心室重構等過程[12]，對心臟損傷及修復的發(fā)生發(fā)展有重要影響。因此，研究心臟成纖維細胞在疾病過程中發(fā)揮的作用，找到新的治療靶點，對心血管疾病的治療有很大幫助。

轉錄因子ATF3在多種疾病的病理過程中發(fā)揮調節(jié)作用。不同的誘導因素及細胞種類，ATF3可參與調控不同的病理過程。在乳腺癌的發(fā)病機制中，ATF3是增強乳腺癌轉移的髓細胞調節(jié)因子，并且可以作為乳腺癌死亡的預測因子[13]；在LPS引起的炎癥反應中，ATF3通過抑制Toll樣受體通路而抑制炎癥反應[14]；另外，ATF3可以調控血管平滑肌細胞的凋亡和遷移[15]，調控胰島細胞的分泌及凋亡[16]，參與調控動脈粥樣硬化管壁中泡沫細胞的形成等[17]。ATF3在心血管疾病中發(fā)揮的作用是我們研究的重要內容。我們課題組已經報道過，在血管緊張素II灌注和主動脈弓縮窄導致心肌肥厚的兩種小鼠模型中，心臟成纖維細胞中有轉錄因子ATF3的表達，提高ATF3的表達可以緩解由于后負荷增大導致的心肌肥厚，并減少心臟重構[18]。

為了關注ATF3與成纖維細胞在缺血再灌注損傷中的聯(lián)系與作用機制，我們實驗組構建了ATF3成纖維細胞特異性敲除小鼠。Cre/loxP 重組酶系統(tǒng)在新型基因構建中廣泛應用，細胞水平用 Cre 重組酶識別 loxP 位點將目的基因切除，個體水平上將重組雜合子小鼠與 Cre 轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除目的基因的條件性敲除小鼠[19]。我們將雌激素受體的配體結合區(qū)和Cre重組酶進行融合，雌激素使其進入核內發(fā)揮作用。避免內源性雌激素所造成的非特異性基因敲除，將雌激素配體結合區(qū)進行關鍵氨基酸突變，實驗之前外源性給予雌激素類似物他莫昔芬，促使Cre酶發(fā)揮作用。ATF3在基礎狀態(tài)下表達量很低，興奮狀態(tài)下表達升高，為了鑒定敲除小鼠構建成功，我們給予子代小鼠心臟缺血再灌注手術，無論是mRNA水平還是蛋白表達，野生型小鼠成纖維細胞ATF3表達升高，敲除組ATF3基本不表達，表明成纖維細胞特異性敲除ATF3的小鼠構建成功，為接下來研究心臟成纖維細胞ATF3在心血管疾病中的作用及機制提供了重要條件。