CXCR4抑制劑AMD3100對人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞凋亡的影響

龍 芳，文 芳，聶 蕾，張其柱，吳章穎，訾 聃△，張家龍，李 誼

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，貴陽 550004； 2．貴州省六盤水市婦幼保健院婦產(chǎn)科 553000；3.貴州省六盤水市人民醫(yī)院病理科 553000；4.貴州省六盤水市婦幼保健院病理科 553000)

卵巢惡性腫瘤是我國女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，資料顯示，卵巢腫瘤發(fā)病率越來越高，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅。在全球范圍內(nèi)，每年有12.5萬人死于卵巢腫瘤[1]，2010年我國因卵巢癌死亡的病例約1.76萬例[2]。卵巢腫瘤形成過程中存在著包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡調(diào)控基因的失調(diào)等各類基因表達(dá)的異常情況發(fā)生，同時研究發(fā)現(xiàn)腫瘤易發(fā)生細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的特性與趨化因子受體可促進(jìn)腫瘤的生長、血管的生成及腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。有足夠的原始研究性文章可以證實趨化因子12(CXCL12)/CXCR4 在腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中起到非常關(guān)鍵的作用。在眾多凋亡控制基因中，B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)蛋白家族和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)家族最受關(guān)注，目前國內(nèi)外對于CXCR4與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子(Bcl-2、Bax、caspase-3)聯(lián)合研究較少，故本研究希望為卵巢癌的靶向治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織及細(xì)胞來源 選擇貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、貴州省六盤水市婦幼保健院病理科及貴州省六盤水市人民醫(yī)院病理科存檔石蠟標(biāo)本上皮性卵巢癌患者39例為惡性組，其中早期(FIGO Ⅰ、Ⅱ)卵巢癌26例，晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ)卵巢癌13例，漿液性癌35例，黏液性癌4例，年齡29～72歲，中位年齡49歲。選擇同一時期40例卵巢良性上皮腫瘤患者手術(shù)切除標(biāo)本作為良性對照組。卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3購自昆明醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫中心。

1.2主要試劑 DMEM高糖、胰酶消化液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、雙抗(美國Hyclone)，胎牛血清(德國PAN Bitech公司)，CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3多克隆抗體(英國Abcam公司)，AMD3100(美國Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，PBS沖洗2～3次，0.25%的胰酶常規(guī)消化傳代。細(xì)胞分為3組：陰性對照組(PBS)、AMD3100 10 μg/mL組及AMD3100 100 μg/mL組。

1.3.2免疫組織化學(xué)法 收集的標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)切片行蘇木素-伊紅(HE)染色。免疫組織化學(xué)染色方法按試劑盒說明書進(jìn)行，每批染色均用PBS代替一抗作陰性對照，陽性對照片由武漢博士德生物工程有限公司提供。采用雙盲閱片，半定量積分法判定結(jié)果。以細(xì)胞核、細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈黃色顆粒為陽性，每張切片于高倍鏡下選10個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分比小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。染色呈淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。以上兩項評分的乘積小于3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

1.3.3Western blot檢測CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平 取對數(shù)生長期細(xì)胞，置于無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，提取OVCAR3細(xì)胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后脫脂，室溫封閉2 h后加入一抗抗體，4 ℃過夜，TBST漂洗后，分別加二抗孵育，后用TBST漂洗，加入DAB顯色液，待陽性區(qū)帶顯色清晰后拍照記錄。

1.3.4細(xì)胞凋亡實驗 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化,制備成細(xì)胞懸液，計數(shù)板計數(shù)，取含10萬個細(xì)胞以上的細(xì)胞懸液，PBS溶液重懸加入Annexin溶液混勻，室溫避光孵育10～15 min，離心，PBS 洗滌細(xì)胞，重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶(PI)染色細(xì)胞，4 ℃下避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在惡性組及良性對照組中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示惡性組CXCR4、Bcl-2的表達(dá)高于良性對照組，Bax表達(dá)低于良性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；caspase-3在惡性組和良性對照組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；惡性組CXCR4蛋白的表達(dá)與Bcl-2呈正相關(guān)(r=0.480,P<0.05)，與caspase-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.475，P<0.05)。Bax、Bcl-2之間無相關(guān)性(P>0.05)，見表1，圖1。

表1 CXCR4、Bcl-2、Bax 及caspase-3在兩組腫瘤中的表達(dá)(n)

圖1 EXCR4、Bax、Bcl-2、caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

項目nCXCR4-+χ2PBcl-2-+χ2P年齡(歲)0.4420.6471.0910.296 ≤603415191222 >6053232病理分級(期)9.6120.00212.4420.000 G1～G21111092 G3281711622病理類型1.5320.3180.3600.548 漿液性3515201421 黏液性43113淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14.3150.00011.8300.001 陰性18144126 陽性21417318大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移7.6390.0067.8310.005 陰性13103 94 陽性26818620腹水癌細(xì)胞0.1990.7527.4620.006 陰性1899117 陽性21912417臨床分級(級)7.6390.0060.0110.918 Ⅰ+Ⅱ13103914 Ⅲ+Ⅳ26818610CA125(IU/L)5.3720.0352.368 0.124 ≥353212201418 <3576116

續(xù)表2 上皮性卵巢癌組織中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表2 上皮性卵巢癌患者中CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2CXCR4、Bcl-2、Bax和caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 CXCR4在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、臨床分期、CA125水平有關(guān)(P<0.05)；與年齡、病理類型、腹水中是否找到癌細(xì)胞無關(guān)(P>0.05)；Bcl-2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹水中是否找到癌細(xì)胞有關(guān)(P<0.05)；與年齡、病理類型、臨床分期、CA125水平無關(guān)(P>0.05)。Bax 在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA125水平有關(guān)(P<0.05)；與年齡、病理類型、臨床分期、腹水中是否找到癌細(xì)胞、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、病理分級無關(guān)(P>0.05)；caspase-3在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P<0.05)；與年齡、病理類型、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹水中是否找到癌細(xì)胞、CA125水平無關(guān)(P>0.05)，見表2。

A:Western blot圖；B：定量分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖2不同濃度AMD3100對卵巢癌細(xì)胞CXCR4的

蛋白表達(dá)水平的影響

A：Western blot圖；B～D：Bax、Bcl-2、caspase-3定量分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖3不同濃度AMD3100對卵巢瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表達(dá)情況

2.3不同濃度AMD3100對卵巢癌細(xì)胞CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與陰性對照組比較，AMD3100 10 μg/mL組、AMD3100 100 μg/mL組CXCR4蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與陰性對照組比較，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2、3。隨著AMD3100濃度增大，Bcl-2/Bax值變小，見圖4。

2.4不同濃度AMD3100對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響 與陰性對照組比較，AMD3100 10 μg/mL組、AMD3100 100 μg/mL組細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖4 不同濃度AMD3100對卵巢癌細(xì)胞Bax/Bcl-2的影響

A：陰性對照組；B:AMD3100 10 μg/mL組;C:AMD3100 100 μg/mL組;D:凋亡分析圖；a:P<0.05;b:P<0.01

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測OVCAR3細(xì)胞凋亡

4 討 論

卵巢癌是女性患者中常見的癌癥，超過半數(shù)以上的卵巢癌病理類型為上皮性卵巢癌。該病起病隱匿，大多數(shù)患者初次就診時即為晚期，且十分容易轉(zhuǎn)移[4]，其病死率占婦科惡性腫瘤的第1位。可見，了解相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中有積極意義。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞會高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，其與配體趨化因子CXCL12構(gòu)成的 CXCL12-CXCR4 生物學(xué)軸，與腫瘤細(xì)胞的增殖、散播、免疫排斥反應(yīng)及腫瘤的新生血管形成有關(guān)[5-7]，因此，本研究檢測在人體上皮性卵巢癌組織中CXCR4及相關(guān)凋亡因子的表達(dá)，同時利用CXCR4的抑制劑AMD3100，在細(xì)胞實驗中靶向阻斷CXCR4后觀察其對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動性死亡方式。現(xiàn)在認(rèn)為腫瘤可能是細(xì)胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細(xì)胞繼續(xù)存在產(chǎn)生的。常見的凋亡基因有Bcl-2家族、p53家族和caspase家族等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族按功能可分為兩類，一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-2；而另一類具有促進(jìn)凋亡作用，如Bax。研究表明激活Bax基因能促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡[8]，Bcl-2對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡有抑制作用[9]。caspase-3作為凋亡caspase依賴途徑中的中心分子，對調(diào)亡過程起著級聯(lián)放大作用，是大家公認(rèn)的細(xì)胞凋亡下游關(guān)鍵執(zhí)行者，有研究發(fā)現(xiàn)它能有效地阻止血管新生，從而阻止腫瘤的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織CXCR4、Bcl-2的表達(dá)高于良性腫瘤組織，Bax表達(dá)低于良性腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；說明CXCR4、Bcl-2、Bax的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。研究表明表達(dá)CXCR4的SGC7901胃癌細(xì)胞在 CXCL12 的作用下可能激活 PI3K/Akt 信號途徑，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的抗凋亡作用[10]。通過下調(diào)卵巢癌細(xì)胞株中CXCR4 的表達(dá)，能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，并能有效地降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力[11]。筆者推測CXCR4的高表達(dá)可以降低細(xì)胞的凋亡能力，從而參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。本研究在進(jìn)一步研究CXCR4及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)CXCR4、Bcl-2、Bax、caspase-3在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是評定卵巢癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一，說明4者均參與了上皮性卵巢癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白的表達(dá)與Bcl-2呈正相關(guān)，而與caspase-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明CXCR4可能通過某種途徑來調(diào)控Bcl-2與caspase-3，此結(jié)果與有關(guān)報道相一致[12-13]。

AMD3100是一個高度特異性的細(xì)胞因子受體拮抗劑，選擇性抑制CXCL12與CXCR4結(jié)合，阻斷CXCL12、CXCR4生物軸的生理功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。在本研究中，采用Western blot檢測CXCR4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著AMD3100濃度的增大，CXCR4的表達(dá)明顯受到抑制，再次證實了AMD3100可以靶向阻斷CXCR4的表達(dá)。同樣有研究發(fā)現(xiàn)AMD3100作用人淋巴瘤細(xì)胞株Ramos細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，凋亡增加[15]。AMD3100能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞及直腸癌細(xì)胞的凋亡，并能有效地降低其增殖與遷移能力[16]。也能夠引起骨髓細(xì)胞的凋亡的同時減少腫瘤血管的灌注[17]。說明CXCR4可能通過某種路徑對凋亡基因進(jìn)行調(diào)控，從而參與腫瘤細(xì)胞凋亡過程。張丹等[18]研究發(fā)現(xiàn)降低Bcl-2/Bax比值可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖可能的機(jī)制為Bcl-2/Bax值相當(dāng)于啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”，Bax增高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2升高可抑制細(xì)胞凋亡。因此，有研究推斷，Bcl-2與Bax的比值決定著細(xì)胞受凋亡刺激后的生存能力。在本研究中，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：隨著AMD3100濃度的增大，Bcl-2/Bax值變小，細(xì)胞凋亡率增加。caspase-3在機(jī)體中與別的凋亡蛋白家族成員發(fā)揮相互作用，通過降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，激活caspase家族成員發(fā)生水解，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA在核小體連接處被分割成DNA鏈接片段，細(xì)胞凋亡由此發(fā)生。在本研究中，隨著AMD3100濃度的增加，caspase-3的表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡明顯增加，此結(jié)果與龐雪利等[19]研究結(jié)果相一致。故可推測，CXCR4可能通過某種途徑調(diào)控Bax/Bcl-2值的變化，同時上調(diào)caspase-3的表達(dá)，因此筆者推測阻斷CXCR4的表達(dá)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

卵巢癌是婦科高發(fā)的惡性腫瘤之一，治療后易復(fù)發(fā)的特點是臨床治療的一個難點。本研究表明，利用特異性抑制劑AMD3100對CXCR4進(jìn)行靶向阻斷，增加了細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過阻斷CXCR4后抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時促進(jìn)Bax、caspase-3表達(dá)實現(xiàn)的。這或許能成為卵巢癌治療的一個新的理論依據(jù)，但其確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。