牙齦卟啉單胞菌與食管癌臨床病理特征和預后的關系

李碩果，賈瑞諾，高社干

(河南科技大學第一附屬醫院腫瘤內七科，河南洛陽 471003)

自幽門螺桿菌在胃癌的中的作用被發現后[1]，多種病原菌與癌癥的關系已經被報道，包括傷寒沙門氏菌與膽囊癌[2]，痤瘡丙酸桿菌與前列腺癌[3]，大腸桿菌與結腸癌[4]等。 食管癌是第8位常見的惡性腫瘤，在癌癥死因中排第6位。大部分發生在亞洲，尤其是中國[5]。 它有兩種主要的組織學亞型，包括鱗癌和腺癌,且早期診斷困難，病死率高。因此，減少發生和降低病死率是必要的。

慢性牙周病的微生物群中含有豐富的革蘭陰性厭氧菌。其中，牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis,PG)是一種關鍵的口腔致病菌，它能侵入上皮細胞，干擾宿主免疫反應和細胞周期[6-7]。流行病學表明牙周病和牙齒的缺失及某些癌癥有關，比如口腔癌、胃癌、胰腺癌[7-10]?？谇击[癌細胞中，PG通過激活ERK1/2-Ets1、p38/HSP27和 PAR2/NF-κB通路進而誘導MMP-9 表達促進了細胞遷移[10]。因為食管黏膜在組織學上與口腔黏膜相似，因此筆者認為口腔疾病可引起食管感染，PG 可能與食管癌有關。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經本院倫理委員會批準，并取得患者書面知情同意。選擇2010-2014年本院接受手術治療的食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者100例，患者術前均未接受放化療，并取相應癌旁組織(距離癌組織3 cm以上)；另外30例活檢標本取自胃鏡檢查時，且病理證實為正常食管黏膜組織。4 μm厚連續切片，進行免疫組織化學SP法染色觀察。

1.2試劑和方法 SP超敏免疫組織化學試劑盒購于福州邁新公司。兔抗人PG蛋白多克隆抗體和鼠抗人Lys-gingipain(Kgp,PG分泌的獨特蛋白酶，批號15C8G5E6C2)單克隆抗體由美國路易斯維爾大學實驗室獲贈被用于檢測PG感染?？雇肐gG 和正常鼠 IgG 被作為陰性對照。PG及Kgp原始抗體稀釋濃度為1∶1 000及1∶500。

1.3結果評估 每個組織切片由兩位資深的病理學專家評估。結果判定按陽性細胞百分率評分：<10%為0分，10%～<30%為1分，30%～<60%為2分，≥60%為3分。≥2分被看做PG或Kgp染色陽性。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0軟件分析數據，計數資料采用χ2檢驗，隨訪30個月，以死亡為終點事件，生存分析采用Kaplan-Meier法并用Log-rank檢驗，生存狀態影響因素分析采用COX回歸。以P<0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PG蛋白在ESCC組織中高表達 PG蛋白在ESCC組織及癌旁組織中高表達，且在ESCC組織(60%)中的表達高于癌旁組織(15%)，在正常食管黏膜中不表達(P<0.01)，見表1。PG蛋白的表達主要定位于細胞質，偶爾也位于細胞核，見圖1。

2.2Kgp在ESCC組織中表達 Kgp在ESCC組織中表達 (68%)明顯高于癌旁組織(40%)，且在正常食管黏膜中不表達(P<0.01)，見表1。Kgp的表達也主要定位于細胞質，偶爾也位于細胞核，見圖2。

表1 PG蛋白及Kgp在食管癌中的表達及與臨床病理的關系[n(%)]

A：高分化；B：中分化；C：低分化；D：正常食管黏膜

圖1 PG蛋白在食管癌中的陽性表達(SP×400)

A：高分化；B：中分化；C：低分化；D：正常食管黏膜

圖2 Kgp在食管癌中的陽性表達(SP×400)

2.3PG蛋白表達與ESCC臨床病理特征呈正相關 PG蛋白及Kgp的表達均與患者的年齡、性別、有無吸煙史無關，與分化程度、淋巴結轉移、TNM分期相關(P<0.05)，見表1。

2.4PG蛋白和Kgp表達的相關性 100例ESCC組織標本中，58%的標本PG蛋白和Kgp均為陽性(表2)。PG蛋白的表達與Kgp的表達呈正相關(P<0.01，r=0.601)。

表2 PG蛋白與Kgp表達之間的關系(n)

2.5PG蛋白、Kgp表達與ESCC的總生存相關性 根據染色情況，將PG蛋白和Kgp的表達歸為兩組：陰性表達組和陽性表達組，分析PG蛋白和Kgp與預后之間的關系，繪制Kaplan-Meier生存曲線。PG蛋白陽性表達組30個月生存率為44.4%，低于陰性表達組的71.9%，差異有統計學意義(χ2=8.392，P=0.004)，同時COX回歸多因素分析顯示淋巴結轉移是ESCC患者累積生存率的獨立預后因素(Waldχ2=9.232，P=0.002)。同時，Kgp陽性表達組30個月生存率為55.3%，低于陰性表達組的83.3%，差異有統計學意義(χ2=4.050，P=0.044)，COX回歸多因素分析顯示淋巴結轉移是ESCC患者累積生存率的獨立預后因素(Waldχ2=6.497，P=0.011)，見圖3。

圖3 食管癌組織中PG及KGP表達水平與患者預后的關系

3 討 論

流行病學研究已證實細菌感染能夠增加某些腫瘤的罹患風險，如幽門螺桿菌和胃癌[1]，中國食管癌高發區林州人群隨訪發現牙齒缺失與ESCC發生呈正相關，而PG蛋白感染及口腔微生態失衡是慢性牙周炎和牙齒脫落的主要致病菌[11]。越來越多證據表明：PG蛋白與多種消化道、呼吸道腫瘤的發生、發展相關[7-10]。目前有關研究認為：口腔關鍵致病菌之一的PG蛋白數量異常增加是造成口腔局部微生態失衡的重要因素之一。與口腔緊鄰的消化管道食管上皮均為鱗狀上皮，不可避免成為口腔細菌的定植場所之一。

本研究發現PG作為一個潛在的病原體，在ESCC患者的食管黏膜中不僅能被檢測到，并且PG蛋白在ESCC組織中的表達明顯高于相應癌旁組織，而在正常食管黏膜中不表達，PG低分化組表達明顯高于中高分化組(P=0.025)，淋巴結轉移組的表達率高于無淋巴結轉移組(P=0.029)，Ⅲ期患者表達陽性率高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P=0.036)，PG分泌的獨特蛋白酶Kgp亦有同樣的表達趨勢。因此筆者認為，PG的表達與多種病理因素有關，包括分化、轉移、TNM分期、總生存。這些發現表明PG感染可能是ESCC的一個新的危險因素，也許是食管癌的預后靶標之一。

PG和宿主細胞相互作用的許多方面提示了PG可能介導機體的癌變過程[12]。(1)慢性炎癥與腫瘤的發展有關，比如，已知增加IL-6和STAT3活性可以促進腫瘤發生[13-14]。有關研究表明PG激活JAK2和GSK3β通路，從而增加了上皮細胞中IL-6的產生[13]。(2)PG也通過多種途徑產生抗凋亡作用，包括Jak1/Akt/STAT3的活化，增加Bcl-2 (抗凋亡)∶Bax(促凋亡) 的值，阻礙細胞凋亡效應器細胞色素C的釋放，以及下游凋亡蛋白酶的活化。(3)PG能上調微RNAs(micro-RNAs)，例如miR-203在牙齦上皮細胞中可以抑制凋亡[15]。同樣的PG能通過激活cyclin/CDK加快細胞周期進程，減少腫瘤抑制因子p53的水平。(4)PG可能誘導致癌物質產生，例如，PG可以將乙醇轉化為致癌物質乙醛，可誘導 DNA損傷、突變和上皮增生，這可以解釋飲酒與某些癌癥發生的流行病學證據[7]。

PG可能促進了食管上皮細胞的轉化。本研究結果表明PG感染與ESCC發生呈正相關，PG作為ESCC新的病原體或輔助因子，其意義是巨大的，它暗示了改善口腔衛生可能降低ESCC的危險性，篩查牙垢PG也許能辨別易感人群，應用抗菌藥物或者其他的抗菌方法也許能夠預防ESCC的進程。

PG感染與ESCC的關系暗示了真核細胞溶解酶可能成為ESCC的一個新的有效治療方法。最后，PG感染促進了口腔益生菌的共生轉化，這個過程對于牙周疾病的進展是重要的[16]。食管黏膜微生態失調也許能引起或加速食管病變[6]。因此，結果表明在ESCC發展中感染PG可能會導致食管微生物態的變化。

總之，本研究表明PG存在于ESCC患者的食管上皮細胞中，PG感染與ESCC的嚴重程度及差的預后有關，且與ESCC的進展有關。PG可能是食管癌的生物標志物之一。重要的是，這些數據表明，根除口腔致病菌可能有助于ESCC的治療。