利用SSR標記構建枸杞品種分子身份證

尹躍 趙建華 安巍 李彥龍 何軍 曹有龍

（寧夏農林科學院國家枸杞工程技術研究中心，銀川 750002）

中國是世界上枸杞生產大國，2012年枸杞栽培面積和產量分別為1.454×105hm2和2.049×105t，均居世界第一［1］。寧夏是世界枸杞發源地和正宗原產地，品種資源豐富，現已審定枸杞品種有20個，收集保存種質資源2 000份以上［2］。隨著枸杞品種選育和推廣速度加速，各地品種資源交流更加頻繁，造成同物異名和同名異物現象非常普遍。另外，枸杞品種選育主要采用群體選優方式，使得核心骨干親本反復利用，如從“大麻葉”生產園中先后選育出“寧杞1號”、“寧杞2號”、“寧杞4號”和“精杞4號”等［3-6］品種，造成品種間遺傳差異變小，遺傳背景狹窄，為枸杞品種的準確鑒定提出更高的要求。

傳統的形態學、同工酶等品種鑒定方法易受環境的影響，不僅需要具備扎實的專業理論知識，而且耗時費力。隨著DNA分子標記技術快速發展，SSR標記具有共顯性、多態性高、擴增結果穩定及重復性好等優點，已被國際植物品種保護聯盟（UPOV）納入農作物品種制定DUS（Distinctness，uniformity，stability）指南內容，確定為植物新品種保護最廣泛應用的分子標記體系［7］。目前，利用SSR標記構建了葡萄、梨、棉花、水稻及蘋果等［8-12］植物分子身份證。

近年來，基于高通量測序技術開發了大量的枸杞SSR引物，篩選出了一批多態性好的引物。黨少飛等［13］對大麻葉枸杞進行簡化基因組測序（RAD-seq），分析了SSR基元分布特點，其中三堿基重復單元最豐富，占重復序列總數的66.5%。王瑛等［14］通過對寧夏枸杞和黑果枸杞轉錄組測序開發了ESTSSR引物，從中篩選出10對EST-SSR引物可將7個枸杞品種逐一區分開來。尹躍等［15］從11對SSR引物中篩選出4對引物可將12個枸杞品種完全區分開來，構建了12個品種指紋圖譜。邵千順等［16］利用4對SSR引物構建了17份枸杞種質的DNA指紋圖譜。Chen等［17］基于枸杞果實轉錄組測序，開發了一批EST-SSR引物并對11份枸杞種質進行遺傳多樣性分析。上述研究主要是基于轉錄組和簡化基因組測序開發的SSR標記，這些標記沒有定位到染色體和連鎖群上，在進行枸杞品種鑒定及遺傳多樣性分析時所反映供試材料的信息不夠全面。然而，基于枸杞全基因組水平的SSR標記的開發及應用還未見報道。

本研究是基于枸杞全基因組測序結果（未公布）基礎上，從600對SSR引物中篩選出多態性高、穩定性好、均勻分布在枸杞12條染色體上的24對引物，以16個枸杞品種為試材，建立枸杞品種SSR分子身份證，以期枸杞品種鑒定及知識產權的保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的16個枸杞品種（表1），其中包括果用品種14個和菜用品種2個，均采自寧夏農林科學院國家枸杞工程技術研究中心枸杞種質資源圃（38°38′49″N，106°9′10″E）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測 采用試劑盒法（天根，DP320）提取枸杞葉片基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用BioPhotometer plus核酸蛋白儀（德國，Eppendorf）測定DNA濃度和純度，并用滅菌的ddH2O將溶液稀釋至50 ng/μL，用于后續PCR試驗。

1.2.2 引物來源、設計與合成 SSR引物來源于枸杞全基因組測序（數據未公布）序列所開發，利用Primer Premier5.0軟件隨機設計引物600對，由ABI公司合成，并分別用FAM（藍色）和HEX（綠色）2種熒光集團修飾上游引物5′端。

1.2.3 PCR擴增及產物檢測 PCR擴增體系15 μL，含 有 50 ng/μL DNA 模 板 1 μL、10×Buffer 1.5 μL、10 μmol/L dNTP 1.2 μL、5 μmol/L 上游引物 1 μL、5μmol/L 下游引物 0.2 μL、5 μmol/L M13熒光引物0.8 μL、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL 和 ddH2O 9.2 μL。PCR擴增在GeneAmp PCR System 9600（Perkin Elmer，USA）儀上進行，擴增程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，25 個循環 ；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，10個循環；最后60℃30 min。

在96孔板中每孔加入分子量內標和甲酰胺混合液（0.5∶8.5）9 μL，PCR 產物 1.0 μL，95℃變性 3 min，用ABI3730進行自動熒光檢測。

1.2.4 數據統計分析 利用GeneMapper4.0軟件對原始數據進行分析，獲得不同樣品擴增片段長度。利用SSR數據格式轉換軟件DataFormater 2.7［18］將擴增片段轉換為PowerMarker、Popgene和NTSYS輸入文件。利用PowerMarker V 3.25［19］軟件計算等位基因數（Number of alleles，NA）、基因型數（Number of genotype，NG）和多態信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）。利用 Popgene 32 軟件［20］計算Shannon’s 信息指數（Shannon’s information index，I）。利用在線條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode128.php）構建枸杞品種條形碼身份證。

表1 供試16個品種及分子身份證編碼

2 結果

2.1 引物篩選

通過600對引物對遺傳背景和表型性狀差異較大2個品種（寧杞1號和寧杞菜1號）進行擴增檢測，最終確定多態性高且分別位于12條染色體上的24對SSR引物（表2）用于分子身份證的構建。

2.2 SSR引物擴增多態性

24對引物在16個枸杞品種中共檢測到等位基因155個，每對引物檢測到的等位基因在3（LBSSR0480）-10（LBSSR0076 和 LBSSR0112），平均為6.5個（表3）。24對引物在16個枸杞品種中共檢測到基因型數208個，每對引物檢測到基因型數在3（LBSSR0480）-14（LBSSR0112），平均為8.7個。多態信息含量（PIC）變幅在0.461（LBSSR01-18）-0.848（LBSSR0338），平均為 0.682。Shannon’s信息指數變幅在0.939（LBSSR0480）-2.055（LBSSR0112），平均為1.487。表明所篩選出的引物具有較高的多態性。

2.3 最佳引物組合篩選與指紋圖譜

基于最少引物鑒定最多種質的原則。從24對引物擴增結果中篩選出等位基因數、基因型數、PIC值均大于平均值，且Shannon’s信息指數＞1.7引 物 共 有 6對， 即 LBSSR0313、LBSSR0338、LBSSR0052、LBSSR0423、LBSSR0076 和LBSSR0112。引物兩兩組合，鑒定其對供試枸杞品種的區分率。引物組合LBSSR0052+LBSSR0423鑒定效率最高，可將16個品種全部區分開來，區分率均為100%，其次是引物組合LBSSR0052+LBSSR0112可以鑒定15個品種，區分率為93.8%（表4）。利用LBSSR0052和LBSSR0423這2對SSR引物構建供試品種分子身份證。其中，寧杞1號在這2個SSR位點指紋圖譜見圖1。

2.4 分子身份證編碼

將供試品種全部區分開的2對引物LBSSR0052和LBSSR0423獲得的等位基因按照小到大的順序排列，并用阿拉伯數字01開始賦值（表5）。例如，引物LBSSR0052對16個品種擴增共獲得8個等位基因，最小的為114 bp，賦值為01，依次類推，最大的為191 bp賦值08，記為A的位點賦值為09。將每個品種在2個位點獲得的等位基因按照賦值數字編碼獲得每個品種獨有的字符串（表1）。

再利用條形碼技術將每個品種的按照相同位點順序排列的編碼字符串轉化成每個品種獨特的條形碼標識即分子身份證（圖2）。

表2 24對SSR引物信息

3 討論

3.1 分子標記的選擇

隨著枸杞全基因組測序開展，構建高通量、準確性高，易操作的覆蓋全基因組的枸杞種質資源DNA分子身份證構建將越來越收到重視。一種理想的DNA分子標記具有重現性好、多態性高、易操作、共顯性且覆蓋整個基因組等特點。DNA分子標記技術發展經歷了3個發展階段：第一階段以雜交為基礎的標記（RFLP）；第二個階段以PCR為基礎的標記（RAPD、ISSR和SSR等）；第三階段以單核苷酸為基礎的標記（SNP）［21］。近年來，分子標記廣泛應用各種物種鑒定，國際植物品種保護聯盟在BMT測試指南草案中將構建DNA指紋數據庫的標記確定為SSR和SNP［22］。隨著高通量測序技術發展，開發了大量的SNP，但由于SNP高額費用限制了應用。相比較，SSR標記成為了最廣泛應用的標記。本研究是基于枸杞全基因組測序基礎上，設計開發600對SSR引物，從中篩選24對多態性高的SSR引物，構建了16個枸杞品種的分子身份證。

3.2 SSR擴增產物檢測方法的確定

SSR擴增產物檢測方法主要有兩種：聚丙烯酰胺凝膠銀染技術和毛細管電泳熒光標記技術。郝晨陽等［23］對這兩項技術優缺點進行詳細的比較，得出熒光標記技術具有高通量、數據收集與處理效率高、數據準確、不同實驗室易整合等優點。邵千順等［16］利用15對引物對17份枸杞種質擴增，采用采用傳統的銀染技術，15對引物的平均Shannon’s信息指數I為0.311，本研究24對熒光SSR引物在16個枸杞品種檢測到平均Shannon’s信息指數I為1.487，顯著高于前者。說明本研究采用熒光SSR檢測效率高，數據更為精確可靠，為后續建立枸杞分子指紋數據庫更科學合理。

表4 兩對引物組合對枸杞品種的區分

圖1 寧杞1號在2個SSR位點的SSR指紋圖譜

表5 等位基因賦值標準

圖2 寧杞1號身份證條形碼

3.3 分子身份證的編碼方法

近年來，基于SSR標記構建分子身份證的編碼方法在不斷地創新與發展，主要有3類［9，11-12］：（1）篩選出可以區分所有種質的引物組合，將這些引物擴增到的帶型從小到大排序，依次編碼，按照固定引物順序，串聯帶型編碼，組成一串數據，也就是品種分子身份證；（2）篩選出可區分所有種質的核心引物，將核心引物所獲得等位基因從小到大排序，依次用數字編碼，組成特有字符串構成分子身份證；（3）在第2種方法基礎上進行創新，身份證由商品碼、指紋碼和補充碼3部分組成，構建身份證信息更加全面，且能真實反映品種的信息。針對不同的物種及擴增結果采用相對應的編碼方法。本研究采用第2種方法，從24對引物中篩選出等位基因數、基因型數和PIC值大于平均值，且Shannon’s信息指數大于1.7，最終確定引物LBSSR0052和LBSSR0423組合，可將供試品種全部區分開。將這2對引物在所有品種擴增獲得等位基因由小到大排序，用數字編碼賦值，構建17個枸杞品種分子身份證，為后續構建枸杞分子指紋數據庫提供合理的科學依據。

4 結論

這2對引物組合可區分全部供試品種。根據這2對引物對所有品種擴增獲得等位基因按照由小到大排序，然后將每個品種在這兩個SSR位點的賦值依次組合，構建16個枸杞品種的分子身份證。結果表明SSR標記技術可以作為枸杞品種鑒定和分子身份證構建的有效技術手段。

本研究是基于枸杞全基因組測序結果（未公布）基礎上，從600對SSR引物中篩選出多態性高、穩定性好、均勻分布在枸杞12條染色體上的24對引物，并對16個枸杞品種進行SSR擴增分析，共檢測到155個等位基因，平均為6.5個和208個基因型，平均為8.7個。平均多態信息含量（PIC）和Shannon’s信息指數分別為0.682和1.487。基于最少引物鑒定最多種質的原則，需要同時滿足2個條件：（1）檢測到等位基因數、基因型數和PIC值均大于平均值，（2）Shannon’s信息指數＞1.7。最終確定引物LBSSR0052和LBSSR0423符合要求，而且