畢赤酵母糖基化對布魯菌P39抗原誘導巨噬細胞吞噬的影響

劉思陽 王巖 付玉芹 胡祥坤 王茗宇 盧天成 王秀然

（吉林農業大學生命科學學院 生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，長春130118）

布魯菌病是全球性人畜共患傳染病，可引發家畜（豬、羊和牛）發熱、流產及死亡，對農牧經濟造成重大的損失并嚴重威脅人類的健康［1-2］。Rev.1、S19等減毒菌株是目前可用于控制動物布氏桿菌病的有效疫苗之一，但減毒疫苗存在一定的風險，安全性差［3］。布魯菌抗原在激活宿主免疫時，特別是天然免疫的水平較低，不能形成穩定的免疫保護，因此提高蛋白免疫保護水平成為布魯菌亞單位疫苗的熱點［4］。Denoel等［5］研究表明胞間質結合蛋白（P39）作為T細胞免疫布魯菌抗原可誘導Th1導向型的免疫反應，具有較高的免疫原性，因此P39成為很有前景的亞單位候選抗原。

近年來通過糖基化修飾改變蛋白質的生物學活性，提高蛋白免疫保護水平在疫苗領域備受關注，已有部分疫苗應用于臨床［6-8］。有研究表明，通過糖基化修飾后的蛋白可激活宿主TLR4受體系統，提高宿主細胞天然免疫水平，從而提高抗原的免疫保護作用［9］。

本研究選取可進行糖基化修飾的畢赤酵母表達系統［10］，對布魯菌優勢抗原蛋白P39進行分泌表達，探究其修飾后對巨噬細胞吞噬的影響。為進一步研究糖基化影響蛋白免疫原性的機理，開發新型糖基化布魯菌亞單位疫苗提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Escherichia coliTOP10株購自全式金生物公司（北京，中國）畢赤酵母P. pastoris GS115由山東大學微生物實驗室惠贈（山東，中國）、pPICZαA真核表達載體購自Invitrogen公司（長春，中國）、布魯菌（B.melitensis16M）DNA由軍事醫學科學院軍事獸醫研究所提供。

ExTaq DNA 聚合酶、T4 DNA ligase、EcoR I、NotI、SacI、DNA marker 均為TaKaRa公司產品（長春，中國），Zeocin 為Invitrogen公司產品（長春，中國）；Protein Find Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、Protein Find Goat Anti-Mouse IgG（H+L），HRP Conjugate購自全式金公司（北京，中國）。PNGaseF糖苷酶購自NEB公司（上海，中國）；PVDF膜、濾紙購自promega公司（上海，中國），引物合成及基因測序由上海華大基因有限公司完成（上海，中國）。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母真核表達載體pPICZαA-P39 的構建根據GenBank公布的Brucella melitensis16M（GenBank Accession ID：WP：087932960）序列，應用DMAMAN及primer 5.0基因分析軟件，設計擴增P39基因序列，以布魯菌基因組為模板進行PCR擴增。上游引物序列gaattc（EcoR I）ATGGCACCTGTTGCCAATGC，下游引物序列gcggccg（NotI）TTTTGCGGCTTCAACCGCC。將膠回收的 PCR 擴增產物P39基因與pPICZα-A 質粒用EcoRI、NotI進行雙酶切，將酶切后的P39基因片段用 T4DNA 連接酶連接pPICZα-A 載體上，熱激法轉化大腸桿菌 TOP 10 感受態細胞中。經雙酶切鑒定正確后送上海華大基因有限公司測序。

1.2.2 重組蛋白P39的誘導表達 挑取生長在Zeocin抗性YPD平板上的陽性單菌落，接種于5 mL的BMGY液體培養基中，在50 mL三角瓶中培養，28℃、250 r/min搖床培養16-20 h，至OD600值約為2.0-4.0，此時酵母菌處于對數生長期。離心收集菌液，6 000 r/min，4℃離心，收集沉淀，重懸于5 mL的BMMY液體培養基，轉入50 mL的BMMY液體培養基中，250 mL三角瓶繼續震蕩培養。每隔24 h加入1%的甲醇進行誘導表達。同時電轉化空載體pPICZαA的GS115菌株作為陰性對照。培養96 h后收集樣品，10 000 r/min，4℃離心2 min，取上清進行SDS-PAGE分析蛋白的表達情況。

1.2.3 重組蛋白P39的純化 將收集好的上清液進行真空凍干，10 mmol/L，pH 7.4的磷酸鹽溶液（PBS）透析48 h，0.22 μm無菌過濾器過濾，利用Sephacryl S-100蛋白層析純化柱純化，20 mmol/L NaCl洗脫蛋白，每管3 mL，Nanodrop在280 nm處檢測吸光值，SDS-PAGE鑒定各層析成分。

1.2.4 蛋白P39免疫印跡實驗（Westen blot）鑒定 通過 Western blotting 檢驗純化后的重組目的蛋白。SDS-PAGE后100 V恒壓轉膜55 min。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗3次，加入1∶1 000 稀釋的抗his標簽鼠單克隆抗體，37℃孵育45 min，TBST 漂洗3次后，加入1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育45 min，TBST漂洗3次后用DAB顯色試劑盒進行顯色（購自sigma公司），觀察目的條帶并記錄結果。

1.2.5 發酵條件對蛋白表達量的影響

1.2.5.1 pH值對重組蛋白P39表達量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量分別接入pH值分別為3.0、5.0、6.0、8.0的200 mL BMGY培養基中，鹽濃度0.05M，28℃搖床培養，至OD600值為0.6-0.8時，1%甲醇誘導72 h。

1.2.5.2 磷酸鹽濃度對重組蛋白P39表達量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量分別接入磷酸鹽濃度分別為0.02 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L和0.2 mol/L的BMGY培養基進行培養，pH 6.0，OD600值為0.6-0.8時，1%甲醇誘導72 h。

1.2.5.3 甲醇濃度對重組蛋白P39表達量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量BMGY培養基中，28℃搖床培養，鹽濃度0.05 mol/L，pH 6.0，OD600值為0.6-0.8時，分別以0.5%、1%、2%和3%不同濃度的甲醇誘導72 h。

1.2.5.4 誘導時間對重組蛋白P39表達量的影響 取陽性重組菌以1%的接種量BMGY培養基中，28℃搖床培養，鹽濃度0.05 mol/L，pH 6.0，OD600值為0.6-0.8時，以1%濃度的甲醇分別誘導24 h、48 h、72 h和 96 h。

1.2.5.5 NanoDrop檢測蛋白濃度 以100 μg/mL牛血清白蛋白作為對照，對目的蛋白進行蛋白濃度標定。

1.2.6 酵母分泌表達的P39蛋白糖基化鑒定 將純化后10 μg的真核蛋白加入1 μL糖蛋白變性緩沖液，總體積10 μL。100℃變性10 min，加入2 μL的glycobuffer，10% NP-40和1 μL的PNGaseF糖苷酶，37℃，孵育1 h。500 MHz核磁共振氫譜檢測重組P39蛋白糖基化修飾水平。

1.2.7 巨噬細胞RAW264.7吞噬熒光抗原實驗 將FITC與真核蛋白及原核蛋白進行混合反應，在4℃避光反應18 h后收集樣品。復蘇RAW264.7巨噬細胞后將其以105個每孔接種于24孔板中，加入FITC標記的真核蛋白和原核蛋白，PBS作為空白對照組，熒光顯微鏡觀察巨噬細胞吞噬抗原蛋白情況，分別記錄4 h、6 h不同時間巨噬細胞吞噬蛋白情況。

2 結果

2.1 構建真核表達載體pPICZαA-P39

DNA核酸電泳顯示成功構建pPICZαA-P39真核表達載體，電轉化后挑選出的陽性菌株。條帶大小與理論的片段大小一致為1 206 bp，如圖1所示。

2.2 真核P39抗原表達純化與Western blot鑒定

甲醇誘導陽性轉化子表達，SDS-PAGE檢測P39蛋白的表達，目的條帶在45 kD處，如圖2。目的蛋白條帶與理論值大小一致，純化后的蛋白純度較好，高效液相色譜檢測純化蛋白純度，純度可達93.77%，如圖3和圖4所示。經Western blot免疫印跡法檢測確定該蛋白為P39蛋白，特異性良好，如圖5所示。

圖1 真核表達載體pPICZαA-P39的構建

圖2 SDS-PAGE分析重組蛋白在畢赤酵母中的表達

圖3 純化后重組蛋白P39

圖4 高效液相色譜（HPLC）檢測純化蛋白純度

圖5 重組蛋白P39 western blot鑒定

2.3 真核P39抗原發酵條件的優化

2.3.1 pH值對重組蛋白P39表達量的影響 由圖6-A可以看出，蛋白得率隨pH的升高先增高后降低，當pH至為6時，蛋白的得率最高，實驗表明該重組蛋白在酸性或弱堿性的條件下表達條件較好，所以，最佳的發酵pH 6左右，最高得率為3.86mg/mL。

圖6 不同因素對P39蛋白表達量的影響

2.3.2 鹽濃度對重組蛋白P39表達量的影響 由圖6-B可見，隨磷酸鉀濃度的升高蛋白得率降低，在磷酸鉀濃度為0.05 mol/L時，蛋白得率最高，過高的鹽濃度可能會抑制蛋白的表達，所以，最佳的磷酸鉀濃度為0.05 mol/L，最高得率為3.64 mg/mL。

2.3.3 甲醇濃度對重組蛋白P39表達量的影響 由圖6-C可見，隨甲醇誘導濃度的增加蛋白得率先增加后減少，在甲醇濃度1%時，蛋白得率最高，低濃度和高濃度的甲醇對蛋白的表達都有不利影響，最佳的甲醇誘導濃度1%，最高得率為4.96 mg/mL。

2.3.4 誘導時間對重組蛋白P39表達量的影響 由圖6-D可見，隨誘導時間的增加，蛋白得率出現先增加后下降的趨勢，過長時間的誘導不利于目的蛋白的表達，實驗表明，誘導72 h的條件下，長時間的誘導可能導致蛋白降解，所以，72 h蛋白得率最高，最高得率為5.05 mg/mL。

2.4 酵母分泌表達的P39蛋白糖基化鑒定

本研究對酵母表達的 P39蛋白和利用PNGaseF糖苷酶酶解的 P39蛋白利用核磁共振氫譜進行了糖基化修飾分析，結果（圖7-C）表明，重組蛋白圖譜在3.6-3.8 ppm處出現寡糖H信號，說明在純化后的重組蛋白上存在糖信號，重組后的 P39蛋白在畢赤酵母中發生糖基化修飾。同時利用PNGaseF糖苷酶酶解蛋白N-糖鏈后的重組 P39蛋白糖信號未消失，P39 蛋白存在潛在的糖基化修飾位點，但酶解后糖信號仍然存在，說明蛋白的糖基化形式不是理論上N-糖修飾類型，畢赤酵母表達系統對蛋白的糖基化修飾主要表現為N-糖修飾和 O-糖修飾兩種類型，綜合上述結果表明該重組 P39蛋白的糖基化形式可能是O-糖基化修飾［11-12］。

圖7 一維核磁共振氫譜（1H NMR）分析蛋白糖基化

2.5 巨噬細胞RAW264.7吞噬熒光蛋白

熒光顯微鏡觀察實驗結果顯示，兩種蛋白在 2 h開始出現熒光，熒光強度隨時間呈現增強趨勢，真核蛋白出現熒光效果早于原核蛋白，在 6 h時熒光現象明顯，PBS空白對照組未見明顯熒光細胞。根據圖8顯示，巨噬細胞吞噬真核蛋白的熒光強度明顯優于吞噬原核蛋白。說明糖修飾對巨噬細胞的吞噬作用具有一定的影響，可增強蛋白的免疫原性［13］。

圖8 檢測巨噬細胞吞噬熒光蛋白情況

3 討論

布魯菌進入宿主細胞之后，可被宿主免疫系統分解，同時釋放細胞質結合蛋白，這些蛋白質分子繼續發揮免疫刺激與侵染的作用［14］。P39蛋白是布魯菌優勢抗原，其蛋白可以有效地誘導機體產生特異性免疫應答，而且P39基因在多個不同種型布魯菌中高度保守，該成分可以在不同的布魯菌中形成交叉保護作用，用于制備的新型布病疫苗具有較大優勢［15-16］。近年許多研究表明，糖基化對蛋白的結構和活性有很大的影響，消除N-糖基化位點可延長IFN-α/ Fc融合蛋白的半衰期［17］，糖鏈長短的變化及不同糖型的修飾都會影響蛋白的生物活性［18-19］，本課題組發現甘露六糖修飾后的布魯菌 AHCY蛋白的免疫性得到大幅度的提升［20］，說明糖修飾會改變蛋白的生物功能，這為開發安全有效的布魯氏菌亞單位疫苗提供了可能。

本實驗中，為獲得大量 P39抗原，選擇具有分泌優勢的畢赤酵母表達系統，并在酵母體內對 P39抗原蛋白進行天然的糖基化修飾。結果發現，糖基化后的 P39蛋白更容易被巨噬細胞捕獲，與原核表達的 P39蛋白相比，其結合巨噬細胞的效率更好，也更有可能高效的激活巨噬細胞。重組后的 P39蛋白顯示出優于原核 P39蛋白的免疫原性，這可能是由于糖鏈的存在及其結構引發的改變，在 P39蛋白的理論 N-端糖基化位點并為發生修飾作用，說明糖基化的修飾可能存在隨機性，或是由于蛋白空間結構折疊后掩蓋其理論的糖基化位點，使其潛在的糖基化位點未進行修飾。隨著基因工程的發展，已經實現了在分子水平對酵母糖基化系統進行改造，從而更有利于生產人源糖蛋白藥物及亞單位疫苗的開發［21-22］。

4 結論

本研究成功在畢赤酵母中分泌表達 P39抗原，優化發酵條件產量可達 5.05 g/L，通過核磁共振氫譜結果表明 P39抗原發生糖基化修飾，糖基化修飾后的 P39抗原被巨噬細胞捕獲的程度明顯高于原核蛋白，說明糖基化修飾作用會在一定程度上影響蛋白的免疫原性。