海鞘真菌的形態鑒定及其代謝產物抗菌活性研究

羅國聰 黃蘊怡 柴慧子 雷曉凌 聶芳紅

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，湛江 524088；2. 暨南大學生命科學技術學院，廣州 510632）

由于海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養等特殊生境，使得海洋微生物可產生結構新穎的生物活性物質，包括抗腫瘤、抗炎癥、抗菌、抗寄生蟲等化合物，海洋微生物已經成為新型藥物開發的重要來源。尤其是海洋動植物共附生微生物，積極地參與動植物的代謝活動，在動植物的抗感染、抗吞噬的生態防衛中起了重要的作用［1］。而就近幾年已報導的數據來看，從海洋微生物中發現的新活性物質中，有60% 以上來自于海洋真菌［2-3］。海鞘是脊索動物、尾索動物亞門、海鞘綱的尾索動物，是海洋污損生物之一，我國目前已記錄的海鞘種類有66 種［4］。近年來，從海鞘中發現了生物堿、環肽、神經酰胺、萜類、甾體等活性物質，且含量相對較高，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等顯著的生物活性，引起了許多研究人員的高度重視［5］，人們開始關注這些活性的物質的化學結構，并對海鞘共附生真菌展開抗菌活性的研究。

對于真菌來說，其形態特征是一種重要的分類依據，主要根據菌落、分生孢子梗、孢子及其發育時的形態特征來進行形態學鑒定，依據鑒定結果進行分類［6］。本研究選擇湛江雷州的海鞘作為研究原料，從中分離純化出海鞘共附生真菌，對菌株進行形態學的初步鑒定以及抗菌活性的篩選；篩選出抗菌活性較強且抗菌譜較廣的菌株，結合對海鞘中真菌多樣性的分析確定優選的種屬，旨在為開發海洋真菌代謝產物的資源以及海洋藥物的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 海鞘樣品于2014年3月采自廣東省雷州市流沙蝦塘。

1.1.2 抗菌活性試驗指示菌 細菌指示菌：銅綠假單胞菌（Pseudomons aeruginosa），藤黃八疊球菌（Sarcina lutea），金黃色葡萄桿菌（Staphylococcus aureus）。腐敗菌 ：假單胞菌屬（Pseudomonassp.），庫特氏菌屬（Kurthia gibsonii strainsp.），金黃桿菌屬（Chryseobacteriumsp.）。

1.1.3 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，淀粉培養基，真菌發酵培養基［7］用鹽度為3%的人工海水進行配置。營養瓊脂（NA），瓊脂培養基用蒸餾水配置。

1.1.4 試劑及儀器 乙酸乙酯、甲醇、氯化鈉購自廣州華大化學試劑有限公司；瓊脂粉、營養瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（北京陸橋技術有限責任公司）；YS100雙目生物顯微鏡（日本尼康公司）；722型紫外可見分光光度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 海鞘共附生真菌的分離［8-9］采用平板涂布法，在無菌環境下先用無菌水洗去除海鞘表面的泥沙，再分別取海鞘的外殼、內臟，用均質機均質后，放入無菌水中，震蕩混勻，吸取上述勻漿液制成梯度稀釋液。吸取稀釋液到PDA培養基、淀粉培養基平板上，用涂布棒將其均勻涂布，于28℃培養4-5 d。發現有新的菌絲或菌落長出后立即轉接，分別統計在PDA培養基、淀粉培養基中分離出來的真菌種類及數量。

1.2.2 海鞘共附生真菌的形態鑒定 菌株采用點植法接種，即用接種針沾取少量孢子點植在平板上中心，于28℃培養3-5 d，每隔1 d觀察其菌落表面大小、質地、高度、顏色等菌落特征，借助顯微鏡觀察菌株的個體形態，包括是否產孢、孢子等的大小、規則及顏色等，結合真菌鑒定手冊等對菌株進行形態鑒定［10-14］。

1.2.3 海鞘共附生真菌抗菌活性的篩選 （1）海鞘共附生真菌發酵液粗提物的制備：按40%的裝液量在500 mL錐形瓶中加入真菌發酵培養液，挑取三環菌種接種到培養液中，28℃、180 r/min條件下搖床培養7 d后，經過真空抽濾得發酵液與干菌體。取200 mL發酵液用乙酸乙酯等體積萃取3 次，合并萃取液，于旋轉蒸發儀中減壓濃縮，蒸干萃取液中的有機溶劑，用甲醇清洗旋蒸瓶，將提取物溶解于10mL的甲醇中，即為乙酸乙酯粗提液供試樣品。（2）指示菌菌懸液的制備：將保存的指示菌接種到營養瓊脂斜面37℃傳代培養3次后，用接種環刮取適量的菌體于生理鹽水中，振蕩1 min直至菌體均勻分布，測量OD值，并根據OD值將指示菌濃度調整至細菌數約為106CFU/mL。

1.2.4 海鞘共附生真菌抑菌活性測定 采用雙層平板法［15］，首先在無菌平板上鋪一層素瓊脂，放置無菌牛津杯，然后采用稀釋倒平板法制備含菌平板，待平板凝固后將牛津杯取出，分別將乙酸乙酯粗提液供試樣品150 μL加入到牛津杯中。每組實驗重復3次，并設陰性對照（不加粗提物）。將加好粗體液的含菌平板置于冰箱中擴散3 h后放置于37℃恒溫培養。24 h后觀察抑菌圈的透明程度和邊緣整齊程度，測量并記錄抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 海鞘共附生真菌的分離純化

經分離純化排重后，從海鞘中共分離出14株菌，其中12株分離自PDA培養基，2株分離自淀粉培養基，分別占總菌株分離率的85.7%、14.3%。這說明PDA培養基中的營養成分比淀粉培養基更適合于海鞘共附生真菌的生長繁殖。

2.2 海鞘共附生真菌的形態鑒定

從海鞘中所分離的14株菌株的菌落形態、個體形態菌落見圖1，個體形態的特征描述見表1。根據真菌鑒定手冊對其進行形態學的初步鑒定，以上的鑒定結果顯示，所分離出的14 株真菌分屬4 個屬，分別為青霉屬、曲霉屬、枝孢屬和麥軸梗霉屬。以青霉屬和曲霉屬居多，其中青霉屬為第一優勢種群，青霉屬的菌株占總分離出的菌株的比例為64.3%，曲霉屬為第二優勢種群，占總分離出的菌株21.4%。說明從海鞘中分離出的真菌以青霉屬和曲霉屬為主。另外，麥軸梗霉屬在海洋真菌中的報道出現較少，說明海鞘真菌中多樣性較豐富。

圖1 14株海鞘真菌形態鑒定

2.3 海鞘共附生真菌抗菌活性篩選

海鞘共附生真菌乙酸乙酯粗提物抗菌活性，如表2和圖2所示。從表2中可以看出，在這14 株真菌中，至少有11 個菌株對一種以上的指示菌有一定的抗菌活性。其中有4 株真菌對6 種指示菌都有抗菌活性，分別為Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1，這4株菌的抗菌活性較強且抗菌譜較廣。比較這4株菌的抑菌能力發現，菌株Asc-2-12的乙酸乙酯粗提物的平均抑菌圈直徑最大，均大于21.00 mm，其對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達到21.91 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大達到21.37 mm，對SL1 的抑菌圈直徑最大達到23.13 mm，對SL2 的抑菌圈直徑最大達到23.94 mm。

3 討論

海鞘獨特的攝食習性使其富集大量的共附生微生物［16］，而海洋真菌能夠耐受海洋中的特殊生境如高鹽、高壓、低氧、低光照等，形成能夠產生獨特次級代謝產物的生理特性［17］。本研究以海鞘為原料，從中分離純化出海鞘共附生真菌并以其為研究對象，對其進行形態學的鑒定和抑菌活性研究，共分離鑒定出14株菌株，分屬4個屬，其中青霉屬9株、占64.3%，屬于優勢菌屬。目前，國內已經有對海鞘共附生細菌的研究報道［18］，然而關于海鞘共附生真菌代謝產物抗菌活性的研究報道還比較少［19］。

通過測試14株菌菌絲體乙酸乙酯的粗提取物的抗菌活性，以銅綠假單胞菌、黃八疊球菌、金黃色葡萄桿菌、假單胞菌屬、庫特氏菌屬、金黃桿菌屬為指示菌，其中有4株真菌對這6種指示菌都有抑菌活性，分別是Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1，在這抗菌活性較強的4株真菌，Asc-2-1屬于曲霉屬，其余3株屬于青霉屬。并且青霉屬菌株Asc-2-12 的抑菌活性最明顯，對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達到21.91 mm。珊瑚和海綿共附生真菌的研究發現，分離得到的部分青霉和曲霉菌表現出對細菌的廣譜抑菌活性［20］。因此有必要對以上4株海洋真菌的活性代謝產物進行深入研究。海洋微生物天然產物正在成為創新藥物的一個重要來源，而海洋真菌作為海洋微生物的一個重要類群，具有研究和開發的巨大潛力［21］。

表1 14株海鞘共附生真菌的形態鑒定

表2 海鞘共附生真菌乙酸乙酯粗提物抗菌活性的篩選

圖2 海鞘部分真菌發酵液乙酸乙酯粗提物抗菌活性

4 結論

從海鞘中純化出14 株真菌，經初步鑒定14 株真菌分屬于青霉屬、曲霉屬、枝孢屬和麥軸梗霉屬等4 個屬，其中青霉屬9株，曲霉屬3株，枝孢屬和麥軸梗霉屬各1株。最后對分離純化出的14 株海鞘真菌的乙酸乙酯粗提物進行抗菌活性篩選，發現14 株菌中有11 株菌對一種以上的細菌指示菌有抗菌活性，其中有4 株菌的抗菌活性較強且抗菌譜較廣，編號分別為Asc-2-4、Asc-2-12、Asc-1-1和Asc-2-1，菌株Asc-2-12 的抑菌活性最明顯，對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑最大達到21.91 mm。綜上表明，海鞘共附生真菌存在良好的應用開發潛力，可作為發現新穎抗菌活性物質的潛在資源。