人呼吸道卡他莫拉菌快速檢測膠體金試紙的研制

黃瑩琪 張秋 陶冶 胡征，2，3 張改平 張華山，2，3

（1. 湖北工業大學生物工程與食品學院，武漢 430068；2. 發酵工程教育部重點實驗室（湖北工業大學），武漢 430068；3. 工業發酵湖北省協同創新中心，武漢 430068；4. 河南農業大學，鄭州 450002）

卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis，M. catarrhalis）屬革蘭氏陰性、兼性厭氧雙球菌，是慢性肺病患者中引起下呼吸道感染的重要病原體［1］。該菌不僅引起兒童中耳炎（Otitis media，OM），還引起成年人慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD），甚至會導致急性加重感染患者死亡［1-2］。目前已分離出可產生β-內酯胺酶的M.catarrhalis臨床菌株，該菌的抗生素耐藥性更令人恐慌［3-4］。由于M. catarrhalis引起的臨床癥狀與其他呼吸道病原體感染類似，因此精確的診斷、對癥用藥是臨床治療的重要環節。目前，M. catarrhalis感染的診斷方法主要有血清學檢測法、核酸檢測法［5］和病原體培養檢測法［6］，但都存在檢測時間長、操作步驟復雜、成本較高等缺陷，因此尋找快速、簡便且準確的檢測方法具有重要意義。

本實驗選定M. catarrhalis中具有種屬特異性和保守性的表面抗原蛋白UspA1［7-8］，通過生物信息學預測UspA1蛋白胞外結構域單一線性表位，制備UspA1Line-KLH復合蛋白及重組蛋白UspA1-His多克隆抗體，經純化后分別用于膠體金的標記及檢測線的包被，采用檸檬酸三鈉還原法制備40 nm膠體金顆粒，建立卡他莫拉菌膠體金試紙條檢測方法，旨在為快速檢測呼吸道病原菌提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 本實驗中所有病原菌株均購自美國菌種保藏中心（ATCC），重組質粒pET-28a（+）-uspa1，感受態細胞E.coliRosetta（DE3）均由本實驗室保存。

1.1.2 實驗動物 免疫用新西蘭大白兔由湖北省疾控中心提供。

1.1.3 主要試劑及耗材 Ni SepharoseTM6 Fast Flow，Sephadex G25（10/350） 購 自 GE healthcare公 司；Protein At Beads 4FF，PabPur Sulfolink Beads購 自Smart公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；硝酸纖維素膜（CN140）購自Sartorius公司；玻璃纖維（CB08）、聚酯纖維（DL42）、吸水紙（CH37K）和PVC板購自上海良信技術有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）和檸檬酸三鈉購自國藥集團；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自BioFroxx公司；羧基水溶性量子點（12-18 nm）購自武漢珈源量子點技術開發有限責任公司。

1.1.4 生物信息學分析 UspA1蛋白表面可及性預測及線性表位預測均由武漢百意欣生物技術有限公司提供技術服務。

1.2 方法

1.2.1 UspA1蛋白胞外結構域單一線性表位的預測及合成 利用ABCpred軟件，對UspA1蛋白進行生物信息學結構分析，選定672-685位（GenBank序列號AAF36416.1）的14個氨基酸組成的短肽NTDRIAKNKAEADA（此序列命名為UspA1Line）作為制備兔抗UspA1蛋白抗體的線性抗原表位，將UspA1Line的N端添加一個半胱氨酸后，用多肽自動合成儀合成多肽并純化，純化后的多肽與載體蛋白KLH偶聯，形成UspA1Line-KLH復合蛋白。

1.2.2 重組蛋白UspA1-His的誘導表達及純化 參照文獻［9］方法，誘導表達UspA1-His重組蛋白，并用GE公司的His Trap親和層析柱，按照說明書方法得到純化的UspA1-His重組蛋白，進行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 動物免疫實驗 參照文獻［9］方法對新西蘭大白兔進行免疫。UspA1-His重組蛋白和UspA1Line-KLH復合蛋白的首次免疫計量均為1 mg/只，加強免疫計量均為0.5 mg/只。將效價符合要求的新西蘭大白兔經頸動脈采血，分離血清，-80℃凍存備用。

1.2.4 UspA1-His重組蛋白多克隆抗體的純化 采用GE公司的rProtein A親和層析柱，按照其說明書收集洗脫液，用磷酸鹽緩沖體系超濾濃縮，得到UspA1-His抗體（AbUspA1-His）。超微量分光光度計測濃度定量，分裝凍干，-80℃儲存備用。

1.2.5 UspA1Line-KLH復合蛋白多克隆抗體的純化 參照UspA1-His重組蛋白多克隆抗體的純化步驟得到除鹽后的UspA1Line-KLH復合蛋白抗體。

采用SMART公司的PabPur Sulfolink Beads多肽親和層析柱，按照其說明書偶聯肽鏈UspA1Line，得到UspA1Line多肽親和層析柱。加入除鹽后的UspA1Line-KLH復合蛋白抗體，按照說明書純化抗體，得到高純度的UspA1Line抗體（AbUspA1Line），超微量分光光度計測濃度定量，分裝凍干，-80℃儲存備用。

1.2.6 多克隆抗體效價及特異性檢測 采用間接ELISA法測定抗體效價［9］，測定AbUspA1-His和AbUspA1Line對M. catarrhalis的識別能力。根據450nm 處吸光值（OD450）判斷結果。判定方法：S/N=（待檢 OD450）/（陰性對照 OD450），S/N＞2.1 為陽性。

利用直接免疫熒光法鑒定AbUspA1-His和AbU-spA1Line對M. catarrhalis抗原的識別能力。按說明書方法用可溶性羧基量子點標記AbUspA1-His和AbUspA1Line。以標記抗體作為特異性熒光抗體標記M. catarrhalis。將標記好的菌液固定在載玻片上，滴加Hoechst 33342染料染核。用激光共聚焦顯微鏡觀察M. catarrhalis菌體與量子點標記抗體的結合情況。

1.2.7 膠體金標記免疫層析試紙條的制備 采用檸檬酸鈉還原法［10］制備40 nm膠體金。取1 mL制備好的膠體金加2 μL的0.2 mol/L K2CO3調pH，1 mL膠體金標記4 μg AbUspA1Line，標記好后離心重懸至100 μL，以0.3 μg/cm的量噴涂于玻璃纖維膜上，37℃鼓風干燥箱放置1 h以上。

將上述制備的AbUspA1-His和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2.0 mg/mL、0.5mg/mL。將 AbUspA1-His裝以 1.0 μL/cm 的量在硝酸纖維素膜上劃線，形成檢測線；將稀釋好的羊抗兔IgG以 1.0 μL/cm的量在硝酸纖維素膜上劃線作為質控線，其與檢測線間距為0.5 cm。硝酸纖維素膜37℃真空干燥12 h以上，制得檢測層，4℃密封干燥保存。

按照圖1對檢測卡進行組裝后（結合處均交接2 mm），用斬切機將試紙切割成4 mm的試紙條，與干燥劑一同封裝在鋁箔袋內保存。

1.2.8 檢測方法與判定標準 將待檢樣品溶于生理鹽水，取150 μL滴在樣品墊上進行層析，檢測結果以10 min為準。若質控線（C線）和檢測線（T線）均顯色，則檢測結果判定為陽性；若C線顯色，T線不顯色，則檢測結果判定為陰性；若均不顯色，或只有T線顯色，則說明試紙已失效，結果無效。

1.2.9 試紙條的性能測定 特異性檢測：用試紙條 分 別 檢 測M. catarrhalis（ATCC 49619）、 肺 炎鏈 球 菌S. pneumoniae（ATCC 25238）、 肺 炎 支 原體M. Pneumonia（ATCC 15531）、流感嗜血桿菌H.influenzae（ATCC 9007）、嗜肺軍團菌L. pneumophila（ATCC 33152）等呼吸道常見病原菌稀釋液（10mmol/L PBS將菌體濃度稀釋至1×108CFU/mL），鑒定試紙條的特異性。

圖1 膠體金檢測卡組裝圖

靈敏性測試：將M. catarrhalis用10 mmol/L PBS分別稀釋至 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105及1×104CFU/mL，觀察陽性結果的最低菌濃度。

短期穩定性測試：將同一批次的試紙條置于55℃儲存，每2 d用陽性樣本進行檢測，同時將該批次的試紙條進行3次冷凍到復融的循環，用陽性樣本進行檢測。每個樣品檢測3次以觀察穩定性和重復性。

穩定性和重復性測試：將3個不同批次的試紙條置于24℃儲存6個月，每30 d用陽性樣本和陰性樣本進行檢測，且每個樣本檢測3次以觀察穩定性和重復性。

2 結果

2.1 重組蛋白UspA1-His的誘導表達及純化

重組質 粒pET-28a（+）-uspa1轉化至E.coliRosetta（DE3）后，37℃經IPTG過夜誘導表達，將收集的菌體超聲破碎，取上清和沉淀進行SDSPAGE電泳。由圖2可知，在約24 kD處有明顯的條帶，大小與預期相符，誘導表達成功，目的蛋白以可溶的形式存在在上清中。

重組蛋白經鎳柱親和純化，收集洗脫峰。由圖3可知，含40 mmol/L咪唑和含100 mmol/L咪唑的洗脫液可將目標蛋白洗脫且純度達90%以上。經超濾管濃縮，洗去咪唑后，測定濃度為0.56 mg/mL，總量超過7.8 mg。

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析

圖3 親和純化產物的SDS-PAGE分析

2.2 多克隆抗體的效價

采用間接ELISA法測定抗體的效價。在1∶512 000稀釋度 下，AbUspA1Line和AbUspA1-His的S/N值為13.529、11.838，數值均大于2.1，抗體滴度均達到1∶512 000（圖4）。

2.3 多克隆抗體的特異性

用激光共聚焦顯微鏡觀察到羧基量子點標記的抗體可特異性識別M. catarrhalis（圖5）。

圖4 間接ELISA法測定抗體效價

圖5 免疫熒光法測抗體特異性

2.4 膠體金試紙特異性測試

檢測M. catarrhalis的試紙條，C線和T線均顯色，結果為陽性；陰性對照及其他呼吸道常見病原菌（如肺炎鏈球菌、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌）檢測結果（圖6）均為陰性，說明制備的M.catarrhalis檢測試紙條特異性較高。

圖6 卡他莫拉菌膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測

2.5 膠體金試紙靈敏性測試

結果（圖7）表明，制備的試紙條可檢測菌濃度為1×106CFU/mL的M. catarrhalis稀釋液。

圖7 卡他莫拉菌膠體金免疫層析試紙條的靈敏性檢測

2.6 膠體金試紙短期穩定性測試

結果（圖8）表明，55℃儲存4 d試紙條的靈敏性與新制備的試紙條相比無差別，儲存6 d后檢測線顯色變淺。經3次冷凍到復融循環的試紙條與新制備的試紙條檢測無差別。

圖8 卡他莫拉菌膠體金免疫層析試紙條的短期穩定性檢測

2.7 膠體金試紙穩定性和重復性測試

將試紙條在24℃儲存6個月后，其特異性和靈敏性與新制備的試紙條相比無差別，且平行實驗結果穩定。

3 討論

M. catarrhalis作為引起兒童中耳炎和成人慢性肺阻塞疾病的重要病原菌，它不僅單獨致病，同時會與其他病原微生物共同作用，導致病情的加重及交叉感染［11-13］。由于M. catarrhalis會產生 β-內酰胺酶，所以其對β-內酰胺抗生素敏感的細菌如肺炎鏈球菌等提供保護，使得患者嚴重感染并加大治療難度［14-15］。據統計，在美國，每年治療OM的成本約3-5億美元，而每年治療COPD的成本為約3萬美元/人，快速診斷和精確用藥尤為重要［16］。目前臨床診斷M. catarrhalis感染的“金標準”為病原體培養檢測法［17］。但是檢測時間過長，不能及時指導治療，導致患者病情加重或出現過度用藥的情況。聚合酶鏈反應（PCR）技術雖可檢測卡他莫拉菌，但靈敏度極高，易出現假陽性，不能作為感染診斷依據［18-19］。因此，尋找檢測快速、操作簡單、特異性高的檢測方法具有重要意義。

本研究以M. catarrhalis標準菌株為研究對象，經結構生物學分析迅速找到了UspA1蛋白上14個氨基酸組成的M. catarrhalis表面抗原的單一線性抗原表位，偶聯KLH后免疫新西蘭兔子，得到抗血清。通過Protein A親和層析和多肽親和層析兩步來純化抗體，提高了多克隆抗體的特異性，使之達到了接近單克隆抗體的效果。將其作為金標抗體與膠體金顆粒結合，特異性識別菌體表面UspA1蛋白胞外結構域中線性抗原決定簇，用識別菌體不同表面表位的AbUspA1-His捕獲菌體，形成雙抗體夾心，使T線出現肉眼可見的顏色反應，無假陽性且與其他呼吸道常見病原菌無交叉反應，可檢測呼吸道感染病人呼吸道內是否存在M. catarrhalis大量增殖。

本研究建立的雙抗夾心免疫層析法可在10 min內得到準確結果，相較于其他傳統檢測M. catarrhalis的方法，具有快速、簡便、特異、靈敏的特點，不需要專業人員的培訓和昂貴的儀器設備，尤其適用于醫院對吸道感染病人的實時診斷。由于呼吸道感染常伴隨多種細菌合并感染［20］，該方法不受其他病原菌的干擾，可為之后的呼吸道病原菌快速的檢測提供參考。

4 結論

本研究經結構生物學分析迅速找到了M.catarrhalis特異性表面蛋白UspA1上由14個氨基酸組成的單一線性抗原表位，偶聯KLH后免疫新西蘭兔子，得到抗血清。通過Protein A親和層析和多肽親和層析兩步純化抗體，得到特異性識別菌體表面UspA1蛋白胞外結構域中線性抗原決定簇的抗體AbUspA1Line，用識別菌體不同表面表位的AbUspA1-His捕獲菌體，形成雙抗體夾心，成功研制出可快速檢測卡他莫拉菌的膠體金試紙。