煤地質環境微生物總基因組DNA提取方法的優化

楊秀清 陳彥梅 吳瑞薇 王保玉 韓作穎

（1. 山西大學生物技術研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006；2. 煤與煤層氣共采國家重點實驗室，晉城 048000；3. 易安藍焰煤與煤層氣共采技術有限責任公司，晉城 048000）

煤層氣是成煤過程中生成的非常規天然氣，是一種潔凈的化石能源。據國際能源機構（IEA）估計，全世界煤層氣資源量達263.8×1012m3，約占世界天然氣總儲量的30%以上，而我國的煤層氣資源量約有30×1012-36.81×1012m3，具有巨大的開發潛力。煤層氣的開發不僅能夠改善能源供給結構，同時還有助于煤礦的安全開采，實現溫室氣體的減排，具有重大的社會、環境和經濟效益。近年來，世界上各大產煤國也相繼開展了煤層氣的開發與利用。然而，礙于煤層氣生產井的壽命短，如何實現煤層氣的增產已成為了當今煤層氣開發的重要研究內容。

根據成因不同，煤層氣可分為生物成因氣和熱成因氣。其中，生物成因氣是由微生物降解煤或煤層有機質產生［1］，其存在已在大量煤田中證實［2-4］。目前，國內外關于微生物成氣機理的研究還多集中在實驗室模擬［5-8］，盡管成績顯著，但至今有關煤的生物降解是如何實現的還不是很清楚，從而阻礙了我們采取策略去刺激煤層微生物產生額外的甲烷。解析產氣微生物群落的多樣性有助于掌握功能微生物的類型，為實現調控微生物成氣及揭示微生物成氣機理奠定理論基礎。然而，通過常規的分離培養方法，環境中能培養分離出的微生物僅占環境樣品總數的 1%-10%［9］，無法完整地解析樣品中微生物的種類及豐度。基于環境微生物總DNA，宏基因組學、分子指紋圖譜技術等免培養技術，為揭開不可培養微生物的神秘面紗提供了技術支撐。然而，一些特殊環境中較完整的微生物DNA的提取實屬不易，因此，一種有效的、高質量的微生物基因組提取方法成為決定數據準確全面的關鍵。

煤地質環境樣品組成較復雜，除了含有煤顆粒外，還存在大量理化性質復雜的物質，如腐植酸、煤降解中間產物多環芳烴、酚類等物質［10-11］，這些物質的存在易使環境中的微生物吸附在其表面，不易分開，從而阻止了細胞內總DNA的釋放。其次，腐植酸、酚類等物質的存在會對PCR反應產生抑制，容易造成對環境微生物多樣性的偏低估計［12］。因此，充分裂解樣品中的細胞、除去樣品中的PCR抑制物，成為了獲得高質量微生物總基因組DNA的關鍵。由于煤地質環境微生物基因組DNA的提取及對DNA保障的品質均具有一定難度，所以，目前還沒有一種較適合煤地質環境中微生物基因組高效提取的方法。近年來，關于煤地質環境中微生物總DNA的提取，多數學者均采用土壤試劑盒法［4，13-14］，但試劑盒所針對的樣品在性質和組成上與煤地質環境樣品存在有一定的差異，煤地質環境相對而言含有更加豐富的有機質雜質，高品質DNA的提取就會比其他樣品更加困難，用土壤試劑盒對煤地質環境微生物基因組DNA進行提取未必是一種最佳選擇。重要的是，土壤試劑盒價格昂貴，科研成本高，使用次數有限，不適用于大批量樣品的DNA提取。因此，開發適用于煤地質環境中微生物總DNA大量高效提取的方法對于研究煤層氣田微生物分子生態學及生物成氣機理都具有重要意義。

本研究在參考前人工作的基礎上，通過對傳統DNA抽提方法（酚-氯仿法）進行改進，建立了一種經濟可行的可用于煤地質環境中微生物基因組DNA高效提取的方法。并通過瓊脂糖凝膠電泳及PCR擴增反應來檢測提取基因組DNA的質量，以確定建立基因組DNA提取方法的可行性及可靠性，為研究煤地質環境微生物群落結構及多樣性、生物成氣機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料Rhodococcussp.R04，由山西大學生物技術研究所化學生物學與分子工程教育部重點實驗室保存。無煙煤塊煤，取自山西晉煤集團寺河礦區。煤層水樣，取自山西晉煤集團寺河礦區煤層氣井。煤層氣厭氧富集培養樣，取自山西省晉城市煤與煤層氣共采國家重點實驗室。

1.1.2 主要試劑及培養基配制 TPM緩沖液（50mmol/L Tris-HCl，1.7% PVP，20 mmol/L MgCl2·6H2O）、STE緩 沖 液（6 g/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA）、Proteinase K、十二烷基磺酸鈉（SDS）、酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1 V/V/V）、氯仿/異戊醇（24∶1 V/V）、異丙醇、75% 乙醇、TE緩 沖 液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）、RNase A、DNA聚合酶。

LB培養基（1 L）：胰蛋白胨10 g；酵母膏5 g；NaCl 5 g。

1.1.3 主要器材及儀器設備 高壓蒸汽滅菌鍋、小型粉碎機、臺式離心機、小型珠磨式研磨器Mini-Bead Beater-1、2 mL 戴帽聚丙烯酰胺管、0.1 mm玻璃珠、1.5 mL 離心管、PCR儀、DYY-6C型電泳儀、Gel Doc 2000 UV凝膠成像系統。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取 鑒于煤層水樣和煤層氣厭氧富集培養樣獲取來源珍貴，基因組DNA的提取優化試驗以本實驗室保存菌種Rhodococcussp.R04及煤粉作為試驗材料。

1.2.2Rhodococcussp.R04基因組總DNA的提取優化試驗

1.2.2.1 材料預處理 實驗室中將無煙煤塊煤用小型粉碎機粉碎成粉末，獲得煤粉保存待用；Rhodococcussp.R04用5 mL LB培養基于30℃，200 r/min條件下培養12-16 h，于Rhodococcussp.R04菌液中加入適量煤粉，混勻，收集兩者的混合物于無菌的1.5 mL 離心管中，12 000 r/min離心1 min。用TPM緩沖液洗滌混合物1-2次后，用STE緩沖液洗滌混合物一次，12 000 r/min離心1 min，用STE緩沖液懸浮Rhodococcussp.R04菌體細胞與煤粉的混合物。

1.2.2.2 菌體細胞的破碎 將用STE緩沖液懸起的菌體細胞與煤粉的混合物加入帶螺旋帽的聚丙烯酰胺管中，采用機械振蕩器Mini-Bead Beater-1對收集到的菌體細胞進行破碎。設置5組破碎條件，即2 500 r/min、30 s，2 500 r/min、60 s，2 500 r/min、90 s，4 200 r/min、30 s，4 200 r/min、60 s，進行 5組平行試驗以優化較佳的菌體破碎條件。細胞破碎后將帶螺旋帽管在冰上靜置數秒鐘，取上清液移至無菌的離心管中；再次用STE緩沖液充滿帶螺旋帽管，2 500 r/min運行10 s，冰上靜置數秒鐘，并與第一次的上清液合并。于上清液中加入Proteinase K（終濃度為0.2 mg/mL）和SDS（終濃度為1%），充分混勻后置于55℃水浴鍋內孵育1-2 h，繼續對菌體細胞進行裂解消化。

1.2.2.3 總基因組DNA的抽提、純化及沉淀 向裂解后的液體中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液，充分混勻后，12 000 r/min離心15 min，取上清液至新的無菌離心管中；加入等體積的氯仿/異戊醇混合液進行抽提，充分混勻后，12 000 r/min離心10 min以除去酚類物質和脂類物質，取上清液至新的無菌離心管中；向收集的上清液中加入2倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，-20℃沉淀30 min后，12 000 r/min離心10 min，棄上清；用預冷的75%乙醇洗滌沉淀DNA兩次，12 000 r/min離心10 min，然后置于37℃金屬浴上充分干燥；待DNA沉淀干燥后，向離心管中加入100 μL的TE緩沖液溶解DNA，DNA溶解后加RNase A以消除RNA的污染。

1.2.2.4 基因組總DNA的質量驗證 取5 μL DNA進行瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度為0.7%），以檢測提取基因組DNA的大小及完整性。

1.2.3 煤地質環境樣品基因組DNA的提取

1.2.3.1 改良DNA抽提方法 取煤層水樣和煤層氣厭氧富集培養樣各5 mL于冰上靜置，待大顆粒物質自然沉降后，取上層懸浮液于1.5 mL滅菌的離心管中，12 000 r/min離心1 min，收集菌體細胞。TPM緩沖液與STE緩沖液洗滌菌體、細胞的破碎、基因組DNA的抽提純化、DNA質量的驗證參考1.2.2.3。其中，機械振蕩器Mini-Bead Beater-1對細胞進行破碎時采用1.4.1最終優化的條件。

取大塊無煙煤，用小型粉碎機粉碎后，取1 g煤粉樣品于滅菌的離心管中，依次加入TPM緩沖液與STE緩沖液進行樣品的洗滌后，用STE緩沖液重懸樣品，樣品中微生物細胞的破碎、基因組DNA的抽提純化、DNA質量的驗證參考1.2.2.3。其中，機械振蕩器Mini-Bead Beater-1對微生物細胞進行破碎時采用1.4.1最終優化的條件，提取的樣品基因組DNA溶于15 μL的TE緩沖液中。

1.2.3.2 試劑盒法基因組DNA的提取 煤層水樣（5mL）采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（D5625-01）進行基因組DNA的提取，提取過程參照試劑盒操作說明書進行。簡言之，離心收集煤層水樣中的微生物細胞于裝有Glass beads的1.5 mL離心管中，加入Buffer SLX Mlus高速渦旋振蕩后，加入Buffer DS于70℃水浴中孵育10 min，95℃孵育2 min，6 000 r/min離心3 min，棄沉淀，加入Buffer SP2渦旋混勻，冰浴5 min后離心取上清，加入0.7倍體積的異丙醇，14 680 r/min離心10 min，加入Elution Buffer溶解DNA，加入HTR Reagent渦旋10 s，室溫孵育2 min后離心取上清，加入等體積的XP2 Buffer渦旋混勻后，將混合液轉移到套有收集管的Hibind DNA結合柱中，離心棄濾液，依次用XP2 Buffer及SPW Wash Buffer洗滌DNA沉淀后，用預熱的Elution Buffer洗脫DNA。最后，取5 μL DNA用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 16S rDNA片段的擴增

1.2.4.1 細菌16S rDNA片段的擴增 以提取的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養樣及無煙煤樣基因組DNA分別為模板，用通用引物27F、518R（表1）擴增細菌16S rDNA基因的V1-V3區。反應體系（50μL）：10×EasyTaqBuffer 5 μL ；dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL ；上下游引物（10 μmol/L）各 2 μL ；EasyTaqDNA polymerase 1 μL；DNA模板0.5 μL；最后用無菌的雙蒸水補至50 μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；35 個循環：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；72℃終延伸10 min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4.2 古菌16S rDNA片段的擴增 以提取的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養樣及無煙煤樣基因組DNA分別為模板，用通用引物344F、0691R（表1）擴增古菌16S rDNA基因的V3-V4區。PCR擴增體系及擴增程序同1.2.4.1。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 功能基因mcrA片段的擴增 以提取的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養樣及無煙煤樣基因組DNA分別為模板，采用特異性引物mcrA-F、mcrA-R（表1）進行功能基因片段的擴增。PCR擴增體系同1.4.3.1。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；35個循環 ：95℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 45 s；72℃終延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR擴增引物

2 結果

2.1 不同破碎條件下Rhodococcus sp.R04基因組總DNA的提取

以Rhodococcussp.R04和煤粉為試驗材料進行基因組總DNA提取，對細胞破碎條件進行了優化，不同優化條件下基因組總DNA的提取結果，如圖1所示。由圖1可以看出，在5種破碎力度條件下，均能得到Rhodococcussp. R04的基因組。鑒于破碎強度的不同，提取的基因組DNA都有不同程度的降解及剪切現象。但當破碎強度為2 500 r/min 30 s時，提取基因組DNA的主帶分子量更大，接近23 kb，表明提取的基因組DNA片段更完整，明顯優于其他破碎條件下DNA的提取質量。煤地質環境樣品包含有大量的有機質雜質，易使微生物細胞吸附在其表面，在進行細胞破碎時，微生物很難與吸附介質分開，阻止了細胞內總DNA的釋放，使得基因組總DNA的提取具有一定的難度。采用Rhodococcussp.R04和煤粉的混合物進行基因組DNA提取的優化試驗，是由于兩者的混合物可以較好地模擬煤地質環境樣品，且Rhodococcussp.R04作為一種革蘭氏陽性菌，菌體細胞壁較厚，其在細胞壁破碎難度上與煤地質環境微生物存在有一定共性，且為實驗室保有菌種，容易獲得。而煤層水樣和煤層氣厭氧富集培養樣來源較珍貴，且樣品量少。因此，在進行基因組總DNA提取方案的優化試驗中選用Rhodococcussp.R04及煤粉作為代替樣品進行。綜上所述，我們采用2 500 r/min 30 s的機械破碎條件對煤層水樣及煤層氣厭氧富集培養樣中的微生物進行細胞破碎。

2.2 煤地質環境微生物基因組總DNA的提取

2.2.1 改良DNA抽提方法 采用改良后的DNA抽提方法進行煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養樣及無煙煤樣中基因組DNA的提取，菌體細胞的破碎條件均為2 500 r/min，30 s。DNA提取結果如圖2所示，在瓊脂糖電泳圖譜上，基因組DNA均有微微拖帶現象，但所有樣品的DNA又有明顯的主帶，表明提取的基因組DNA既有完整的片段，又存在降解現象。其中完整的DNA約占總DNA含量的50%，分子量大小接近23 kb，并且提取量大。可以看出，在此破碎條件下，煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養樣及無煙煤樣均能得到較完整的基因組DNA，可用于諸如DNA文庫構建和宏基因組測序等，且DNA提取重復性較好，表明改良后的DNA抽提方法在DNA提取上具有較好的穩定性。

圖1 不同破碎條件下提取的Rhodococcus sp.R04基因組DNA

圖2 改良法提取煤地質環境樣品基因組DNA

2.2.2 試劑盒法 煤層水樣采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit進行基因組DNA的提取，提取結果如圖3所示。提取的2份煤層水樣基因組DNA都有不同程度的降解，DNA主帶不明顯，片段化嚴重，瓊脂糖凝膠電泳圖譜表現為嚴重的拖帶現象（圖3），DNA提取量低，約為改良法的1/10-1/5倍。DNA降解嚴重，這可能是因為在試劑盒提取過程中采用高溫（70℃、95℃）條件對菌體細胞進行裂解，從而導致DNA提取效率較低。相較于改良DNA抽提法提取的煤層水樣及煤層氣厭氧富集培養樣基因組DNA，試劑盒法提取的基因組DNA質量明顯低于改良法，不能用于諸如DNA文庫構建和宏基因組測序等。

圖3 試劑盒法提取煤層水樣基因組DNA

2.3 16S rDNA片段的擴增

2.3.1 細菌16S rDNA片段的擴增 以提取的煤層水樣、厭氧富集培養樣及無煙煤樣的基因組DNA分別為模板進行細菌16S rDNA V1-V3區片段的PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖4所示。改良法與試劑盒法提取的煤地質環境基因組DNA均能作為模板擴增出細菌16S rDNA V1-V3區片段，擴增的目的片段均清晰明亮。但很明顯，試劑盒法提取的煤層水樣基因組DNA（圖3泳道2）為模板擴增的目的條帶的亮度比其他條帶弱（圖4泳道5），進一步表明了試劑盒法所提取的DNA質量差。

圖4 細菌16S rDNA V1-V3區片段的擴增

2.3.2 古菌16S rDNA片段的擴增 以提取的煤層水樣、厭氧富集培養樣及無煙煤樣的基因組DNA分別為模板進行古菌16S rDNA V3-V4區片段的PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖5所示。改良法與試劑盒法提取的煤地質環境基因組DNA均能作為模板擴增出古菌16S rDNA V3-V4區片段，且PCR反應特異性好，擴增的目的片段均清晰單一。同2.3.1結果，試劑盒法提取的煤層水樣基因組DNA（圖3泳道2）為模板擴增的目的條帶的亮度比其他條帶弱（圖5泳道5），證明了模板DNA的質量差。

圖5 古菌16S rDNA V3-V4區片段的擴增

2.4 功能基因mcrA片段的擴增

以提取的煤層水樣、厭氧富集培養樣及無煙煤樣的基因組DNA分別為模板進行古菌功能基因mcrA片段的PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖6所示。改良法與試劑盒法提取的煤地質環境基因組DNA均能作為模板擴增出古菌的mcrA片段，PCR反應特異性好，擴增的目的片段均清晰單一。

圖6 古菌功能基因mcrA片段的擴增

3 討論

基因組DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，保證基因組DNA的完整性是分子生物研究的基礎。本實驗在建立基因組DNA提取的改良法中，于菌體細胞破碎步驟之前，加了煤地質環境樣品預處理過程。因為煤地質環境組成較復雜，除含有煤顆粒外，還含有各種煤降解中間代謝有機物、無機物及各種離子等，它們的存在會極大地影響DNA提取效率及質量，對后續的酶促反應產生一定影響。應用TPM緩沖液和STE緩沖液對煤地質環境樣品進行預處理，可以很好地去除部分雜質，減少部分可溶性PCR抑制劑的污染，特別是減少酚類物質、腐植酸的污染。TPM緩沖液中含有PVP（聚乙烯吡咯烷酮），它是一種合成水溶性高分子化合物，可以從水提物中吸收酚類物質［20］，易和酚類物質形成復雜的氫鍵，隨菌體細胞外雜質共沉淀離心下來，從而減少酚類物質對提取基因組DNA的污染。此外，PVP還可以有效地結合去除部分腐植酸類物質［21］，減少腐植酸類物質對提取DNA的污染。STE緩沖液中含有EDTA，它可以絡合金屬離子，有效抑制核酸酶的活性，防止DNA在提取過程中造成降解［22］。

在菌體破碎步驟，采用了機械振蕩法，及結合化學裂解法和酶裂解法進行細胞破碎，通過對機械破碎條件進行優化，使得菌體細胞既裂解充分，利于基因組DNA的釋放，又保證了大量DNA片段的完整性。

改良法提取的煤地質環境微生物基因組DNA片段完整性較好，而試劑盒法提取的煤地質環境微生物基因組DNA降解及剪切現象嚴重，DNA片段化明顯。應用細菌及古菌的特異引物對改良法和試劑盒法提取的基因組DNA同時進行PCR擴增，均能獲得目的片段，表明兩種方法都能從煤地質環境中有效提取細菌和古菌的基因組DNA，并有效地去除部分抑制劑，不影響PCR擴增。試劑盒法提取基因組DNA雖然方便快捷，但價格昂貴，DNA提取量低，且在高溫條件下（70℃、95℃）提取的煤層水樣中的微生物基因組DNA片段不完整，剪切現象嚴重，導致遺傳信息的缺失，不適用于諸如DNA文庫構建和宏基因組測序等分析的進行。改良法雖然比試劑盒法提取DNA煩瑣一些，但對于腐植酸等含量較低的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養樣及無煙煤樣均能夠獲得質量較高的基因組DNA片段，且DNA提取量高，可用于煤地質環境微生物分子生態學及生物成氣機理研究。此外，改良法所用試劑普通，價格便宜，適于大批量樣品的實驗室和科學研究。

4 結論

通過改進傳統DNA提取方法（酚-氯仿法），并以Rhodococcussp.R04及煤粉為試驗材料進行細胞破碎條件的優化，建立了一種可用于煤地質環境微生物基因組DNA的高效提取方法，即改良法。改良法提取的DNA片段比試劑盒法更加完整，且可以作為模板進行多種特異性PCR擴增，表現出了較高的可靠性。