數字PCR在功能核酸精準檢測中的研究進展

劉曉 朱鵬宇 王垚 朱水芳 付偉

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

隨著分子生物學的快速發展，人們發現并合成了一類具有一定的特殊功能的核酸分子，包含但不限于轉基因產品中的外源插入片段、微生物中的致病基因、核酸適配體（Aptamer）及脫氧核酶（DNAzyme）等，人們把這一類對生物體或體外檢測反應具有特殊功能的核酸分子叫做功能核酸［1-3］。功能核酸的出現開拓了人們的視野也加深了理解，普遍意識到核酸除了作為遺傳信息的載體和運轉載體以外還可以廣泛應用：轉化事件插入產生新型性狀表達，微生物入侵寄主后致病基因的增殖與表達，核酸適配體與脫氧核酶的出現為非核酸物質檢測的發展提供廣闊空間［4-6］，同時還有醫療診斷［7-8］等領域。功能核酸的開發對人類認知疾病類型以及開發新型診斷技術有著重大價值與意義。

PCR是一種體外酶促擴增特異性DNA的實驗技術。從1985年美國科學家 Kary Mullis開發了第一代以PCR技術為基礎進行定性分析的實驗方法后［9］，PCR方法被不斷改進：由定性的分析方法發展到定量測定，從原先只能擴增幾個kb的基因到已能擴增幾十個kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術已有十幾種之多。在這種背景下，第三代基于分割體系的絕對定量PCR應運而生，其中通過有限稀釋法和根據泊松分布統計原理來準確計算DNA濃度的方法，稱為數字PCR（Digital PCR，dPCR）。1992年dPCR初具雛形，Sykes等［10］使用有限稀釋、PCR和泊松分布的方法在非淋巴細胞和正常體細胞的背景下檢測到了低豐度lgH重鏈突變基因，進行了精細的定量研究，但當時并沒有明確指出dPCR這一個概念。直到1999年Vogelstein等［9］首次建立了dPCR基本實驗流程和重要原則：以終點信號的有無作為判斷依據，正式提出了dPCR的概念。Vogelstein等通過對樣品的有限稀釋，檢測了結腸癌患者糞便樣品中KRAS基因突變的同時提出了dPCR的一種優勢：稀釋提高了對反應抑制劑的耐受程度。2003年，Devin等［11］又提出了BEAMing技術（珠子、乳劑、擴增和磁力），利用包被鏈霉親和素的磁性珠子和生物素標記的寡核苷酸形成微乳液進行PCR擴增，該技術為今后的微滴式dPCR的產生奠定一定的基礎。本文將對數字PCR技術及其在現階段不同領域中的功能核酸檢測研究現狀進行歸納和綜述，并對數字PCR未來的發展前景進行展望，旨為促進數字PCR在功能核酸檢測領域進一步的應用。

1 數字PCR

數字PCR是一種基于單分子擴增以及原始反應分割的一種PCR擴增手段。通過將原始的反應體系進行有限的大量分割，將參與擴增的組分和體系中的模板分配到單個的反應小體系中。通過PCR的擴增，當小的反應體系中存在目標分子時，會產生擴增產物并釋放出熒光信號，反之，當體系中不存在目標分子時，該小反應體系為陰性。后續進行數據分析時，需要根據所有體系中的熒光值確定陽性體系與陰性體系的數量，從而根據兩者數量的比較，計算出原始體系中所含有的目標基因的絕對拷貝數［12-13］（圖 1）。

當原始體系中模板的含量相當少時，理論上每一個陽性體系內部只含有單個目標分析，此時，最終結果的陽性亮點數就可以近似等于體系中的目標分子數。但是大部分情況下，樣品中目標分子的量不會太低，此時單個陽性體系中的目標分子的數量可能會達到2個，甚至更多。這時就需要通過泊松分布（Poisson distribution）的原理來計算體系中的總的目標分子的拷貝數。根據泊松分布的原理，反應體系中目標分子的拷貝數可以通過公式1計算［14］：

其中，A為反應體系中目標分子的拷貝數，X為數字PCR的陽性體系數，N為總體系數。

通過公式可以看出，隨著反應陽性體系數（X）的增加，體系中目標分子的拷貝數相對于X會有較大的差距，隨著X的持續增加，數字PCR結果的不確定度也隨著提高，總體來說，數字PCR陽性體系的數量不得超過總體系數量的80%。另一個方面，N的增加會使整個數字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高反應的靈敏度、穩定性以及可重復性。

在常規的定量PCR實驗中，引物的擴增效率會對反應產物量以及定量結果產生較大的影響［15］。但是對于數字PCR來說，最終實驗結果的分析只取決于最終所有小體系的熒光信號而與引物的擴增效率幾乎沒有關系。所以對于數字PCR來說，實驗結果很少會受到引物設計因素的影響。

綜上所述，相對于常規的定量PCR，數字PCR具有極強的絕對定量能力，可以不依賴于標準曲線和標準物質直接對樣品進行目標分子的定量，并且具有很高的靈敏度、穩定性以及可重復性。可以很好的應用在各個領域的核酸分子絕對定量檢測中。

2 商業化數字PCR平臺及其特點

發展到現在，市面上常見的dPCR主要有兩種：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技術（圖1）。

cdPCR主要以Fluidigm公司的BioMark HD系統以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系統為代表（圖2）。Bio Mark系統［16］采用微泵閥式芯片，以聚二甲基硅氧烷為芯片材料，主要依靠微流控通道與閥門的開閉進行原始體系分割，在芯片的反應倉進行PCR反應，然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個通孔的熒光信號，進行目的序列含量的計算。QuantStudio 3D系統［17］采用陣列微池式芯片，反應液由進樣孔直接進入各微反應池。芯片式dPCR生成微滴體積均一，具有較高的穩定性，體系之間影響較小，但技術操作復雜，通量有限且實驗成本較高。

圖1 2011年-2017年數字PCR平臺應用變化趨勢

圖2 芯片式數字PCR平臺宏觀結構（A）微觀結構（B）

ddPCR主要有Bio-rad公司開發的QX200系統和Rain Drop系統，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴［18］（圖3）。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應體系進行微滴化處理，利用微滴發生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量獨立的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應以后，分析每個微滴的熒光信號，進行有或無的判斷，將判斷結果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標和內參核酸的陽性微滴個數以及比例從而得到靶分子的拷貝數及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實現高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩定性。

圖3 微滴式數字PCR原理

與常規的PCR的方法相比，ddPCR有很好的優勢。（1）絕對定量。常規PCR和實時熒光PCR定量檢測都需要已知拷貝數的標準DNA制定標準曲線，由于樣品測定在各種條件上不會完全一致，會造成PCR擴增效率的差異，從而影響定量結果的準確性。而ddPCR不受標準曲線和擴增動力學影響，可以進行絕對定量。（2）樣品需求量低。在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯的優勢。（3）高靈敏度。ddPCR本質上是將一個傳統的PCR反應分成了數萬個獨立的PCR反應，在這些反應中可以精確地檢測到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，且能避免非同源異質雙鏈的形成［19］。（4）高耐受性。由于目的序列被分配到多個微滴中，顯著降低了體系間的影響以及背景序列和抑制物對反應的干擾，擴增基質效應大大減小。盡管dPCR技術具備較好前景，但由于96孔板或384孔板加樣的復雜操作為精確測量帶來了困難，且相較于實時熒光PCR來說成本較高，距廣泛應用還有一定距離。

3 數字PCR在轉基因外源插入片段檢測中的應用

3.1 轉基因產品成分檢測與鑒定

商業作物育種一般通過常規方法或遺傳轉化引入所需性狀，尤其是不存在于植物基因組的新特性。目前隨著市場轉基因產品的逐步釋放，我國必須有涵蓋轉基因的插入、穩定性及性狀表達等所有方面的詳盡檔案。目前被大部分國際組織認可的標準轉基因定量檢測方法是基于Taqman探針的實時熒光PCR，但dPCR作為新興、準確的技術受到越來越多人的青睞。基于Taqman探針的ddPCR是在同一個孔內同時進行內參基因與目的基因的擴增，通過不同信號的陽性液滴比率對目的基因進行定量。

基于數字PCR靈敏度和穩定性較高的優勢，付偉等［20］于2015年開發了一種基于數字PCR的轉基因成分定性篩查檢測體系，通過以CaMV35s啟動子以及NOS終止子作為擴增的目的片段，這兩個篩選元件可以涵蓋95%以上的國內批準的轉基因品系（圖4）。本實驗后續進行了靈敏度、室內穩定性、實驗室間穩定性、特異性及盲樣檢測的驗證，驗證結果表明，檢測體系可以精準穩定的對質量百分比為0.1%的轉基因樣品實現篩查檢測，絕對檢測限可以低至單拷貝。相對于常規篩選檢測體系，具有精準、穩定、結果呈現形式簡單等優點。相對于常規基于數字PCR的轉基因成分檢測體系，本研究消除了樣品前處理過程對檢測體系的影響，可以更快速、更準確的實現轉基因成分的初步篩查。

圖4 基于數字PCR的轉基因成分定性篩查檢測體系［20］

相較于傳統的PCR檢測技術，數字PCR具有微滴數絕對定量的能力，因此數字PCR在轉基因成分定量分析及鑒定方面也有了巨大的研究進展。朱鵬宇等［21］于2016年基于Fluidigm芯片式數字PCR平臺，開發了一種不依賴于樣品前處理步驟的轉基因玉米成分絕對定量檢測體系（圖5），該研究前期驗證了不同的影響因素對于體系的干擾，如SNP位點，樣品前處理步驟等。在體系建立完成以后，又針對8種不同的轉基因品系篩選出了最適合搭配的內標準基因的引物和探針，進而建立了針對8種不同的轉基因品系的二重數字PCR絕對定量檢測體系。該檢測可以精準、快速的對未知樣品中轉基因成分進行定量檢測，操作步驟少，結果穩定性高。

Chen等［22］采用雙通道ddPCR定量檢測方法對轉基因水稻“汕優63”的成分進行分析，擴增“汕優63”的內源基因和菌株特異性序列，準確定量檢測“汕優63”的成分。吳瀟等［23］以轉基因大豆中結構特異性基因為靶基因，利用ddPCR對其進行準確定量，并確定檢測靈敏度高于國標中qPCR方法。Iwobi等［24］將ddPCR應用于選定的轉基因食品和飼料樣品，表現出了ddPCR方法的良好性能。

除了常規數字PCR轉基因成分檢測體系之外，有更強適用性的新型數字PCR的檢測技術也得到了學者們的關注。牛晨啟等［25］于2018年通過結合通用引物技術與數字PCR技術，開發了一種單通用引物多重數字PCR（Single universal primer-multiplexddPCR，SUP-M-ddPCR）轉基因檢測方法（圖6）。研究中，反應體系添加了兩種熒光探針，用來識別轉基因序列的熒光探針（紅色）和用來識別玉米內參序列的熒光探針（黃色）。體系中還同時有通用引物和5對修飾特異引物，即每一對特異引物的5′末端修飾一段相同的通用序列，來擴增P-35S、T-NOS、NPTII、PAT四種轉基因篩選元件和玉米內參adh1基因。這個混合體系被分散在數字PCR的20 000個微滴中獨立發生反應，在PCR過程前10個循環的第一階段，反應體系中同時存在修飾特異引物和通用引物，修飾特異引物發揮作用，擴增出兩端有通用引物的目標序列，第二階段通用引物發揮巨大的作用，保證各個目標序列有統一的擴增效率。通用引物可以有效地減少多對引物之間的干擾。最后通過熒光信號的讀取來對轉基因成分進行檢測和定量。該方法的優點是高通量，其中選取的4種轉基因序列，覆蓋了超過93%的目前已批準的轉基因品系，可以在短時間內對大量樣品進行初步篩查。

圖5 基于Fluidigm芯片式數字PCR平臺的轉基因成分絕對定量檢測體系［21］

3.2 轉基因外源插入片段拷貝數鑒定

dPCR具有高精確度的特點，使用dPCR定量目標基因與參考基因的雙重反應并計算它們的比值，得到目標基因拷貝數，在不同實驗室質檢具有很高的重復性，使其成為測量拷貝數的首選方法［26-28］。

dPCR可以實現復雜基因組拷貝數的準確測定。甘蔗是一種基因組較大且染色體具有高度多倍性和非整倍性的栽培種植物［29-30］，沒有已經準確測得拷貝數的基因，使用常規PCR很難檢測。Yue等［31］通過ddPCR比較3種不同甘蔗品種中內源基因的絕對量，評估3種基因對拷貝數分析的適用性，推導出ATC基因可以成為未來基因拷貝數變異和Q208A和Q240A功能基因劑量研究的合適內源參考基因，并評估了ddPCR在高通量轉基因測定中的應用（圖7）。種質Bru1基因的拷貝數變異能夠使甘蔗產生真菌病害甘蔗褐銹病的抗性，McCor［32］利用篩選的抗性甘蔗進行ddPCR拷貝數分析，說明ddPCR有望用于估計作物等位基因劑量，為育種等進一步研究提供有效信息。

2015 年，Félixurquídez等［33］基于雙熒光通道數字PCR技術開發了一種鑒定轉基因玉米中外源基因拷貝數的鑒定方法（圖8），該方法以外源NOS終止子與玉米內源hmg基因為靶標序列，通過反應退火溫度等反應條件的優化，可以對質量百分比在0.08%以上的轉基因作物進行穩定的拷貝數定量。

圖6 單通用引物多重數字PCR轉基因檢測方法［25］

圖7 抗性甘蔗中數字PCR等位基因分析結果圖［31］

3.3 基因編輯

基因編輯通過序列特異性核酸酶誘導DNA產生切口或雙鏈斷裂，依賴于同源定向修復（Homology directed repair，HDR）或非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）實現定向修復［34-36］。ddPCR可以實現對復雜背景的分區，通過有限稀釋，使得低豐度的目的序列能夠被靈敏的檢出，可以實現對含量較低的基因編輯事件的檢測（圖9）。數字PCR檢測基因編輯的方法主要是將TaqMan PCR測定與ddPCR相結合，在靶標基因同一個擴增子內設計了一個通用引物對和編輯位點特異性TaqMan探針，與不同的熒光基團結合，據雙重熒光信號判斷編輯情況，區分野生型和誘變型DNA序列從而篩選誘變事件。

CRISPR-Cas9技術通常在修復編輯位點中存在有兩種不同的修復機制HDR和NHEJ，其中前者相對于后者可以產生更加精準的基因片段修復結果。由于這兩種修復方式幾乎是存在于相同的編輯片段中的，因此目前常見基因編輯檢測技術是無法對這兩種修復方式的結果進行同時鑒定的。為了克服常用檢測技術的缺陷，Yuichiro等［37］開發了一種可以系統、快速的鑒定HDR與NHEJ修復位點的數字PCR檢測體系（圖10）。這個研究中，Yuichiro以經過CRISPR-Cas9技術處理過的海拉細胞系（HeLa cells）為研究對象，通過在基因編輯片段中的NHEJ位點、HDR位點以及內源親本位點為靶標序列設計探針，實現了通過一對引物的擴增就可以實現基因編輯位點檢測以及NHEJ與HDR分型的目的。該研究可以穩定實現對1 000個野生型基因組中的單拷貝NHEJ/HDR位點的基因分型研究。

圖8 雙熒光通道數字PCR檢測方法［33］

Findlay等［38］通過在原始序列Cas9酶切位點設計探針并采用ddPCR檢測敲除誘導干細胞相關蛋白編碼基因的改變，得到了敏感且特異的篩選基因編輯的方法，并通過ddPCR的陽性熒光信號比對實現了不同TALEN策略的效率評估。Mock等［39］以敲除了CCR5基因的人細胞為例，采用新一代測序（New generation sequencing，NGS）取得TALEN誘導的NHEJ的靶標序列，并針對這段被剪切過的序列設計NHEJ敏感的探針，使得產生NHEJ的靶標序列不產生熒光信號。由核酸酶介導的基因編輯（GEF-dPCR）利用兩個不同標記的探針放置在基因編輯目標位點的一個擴增子內，以同時檢測野生型和非同源末端連接影響的等位基因，通過dPCR結果來評估GEF-dPCR頻率，并利用這種新設計的GEF-dPCR來測量CCR5基因中的TALEN介導的基因敲除，以及CCR2中預期的脫靶位點，以一個比較好的靈敏度和較大的線性范圍對基因編輯進行量化。Miyaoka等［40］使用野生型和突變體等位基因的質粒模板混合物對數百個親本細胞中含有單個點突變的細胞進行了檢測，并發現ddPCR在野生型背景中的適應性可以在檢測到0.1%的突變等位基因，靈敏度比單獨TaqMan PCR高100倍。ddPCR在HEK293T細胞中使用PHOX2B和PKP2靶向的TALEN強力檢測到TALEN誘導的點突變，并且比Surveyor測定更敏感。

圖9 探針檢測方法［36］

總體來說，目前ddPCR檢測基因編輯技術大多采用已知原始序列與模板序列設計HDR與NHEJ敏感的探針的方法，再經過背景不斷稀釋，實現對基因編輯產物有無以及編輯效率的判定。

圖10 數字PCR法NHEJ/HDR位點基因分型實驗原理（A）及實驗結果（B）［37］

4 數字PCR在診斷學功能核酸檢測鑒定中的應用

dPCR具有高靈敏度和精確性的優勢，除了痕量核酸分子檢測、稀有突變等方向，在目前低豐度，背景來源復雜的醫學領域里也有很廣泛的應用。它可以提供研究人員探索復雜的遺傳背景的可能性，發現并驗證新的疾病關聯，開辟分子診斷新的方向。

4.1 痕量核酸樣品的檢測與鑒定

臨床腫瘤診斷主要以篩查患者外周血中特異突變的分子標志物為手段，其重點是血液中游離的腫瘤DNA的液體活檢［41］。由于其具有背景復雜且高度片段化的特點，就要求采用靈敏度高、克服背景序列的檢測方法。目前已有很多文獻報道dPCR成功運用在各種癌基因的檢測中，趙釗等［42］通過數字PCR檢測非小細胞肺癌組織中的表皮生長因子受體EGFR基因T790M突變的差異。Feng等［43］也檢測了79個腫瘤組織和配對血漿樣本的血漿EGFR狀態，并與Super ARMS的結果進行對比，驗證兩者結論具有一致性。Sedlak等［44］利用ddPCR對以染色體重組方式存在的人類皰疹病毒6型的人體血漿樣本進行檢測，靈敏度高達100%。

Beck等［45］證明抑制物DNA增加的量與移植排斥反應有關，同時推測了通過dPCR量化腫瘤衍生的細胞游離DNA（cfDNA）可能提供檢測治療功效的結果。應用定量分子測量對移植管理和監測病毒載量治療實體瘤對提供全新的變化。布魯菌病常規實驗室診斷方法為菌株分離培養，但受環境影響大。郭瑛等［46］首次采用dPCR的方法對其進行探索性的技術檢測，綜合分析布魯菌恢復期病例及dPCR檢測血清布魯菌DNA含量，評估dPCR取代血培養是有前景的但還需進一步驗證。Deborah等［47］利用ddPCR對攜艾滋病嬰兒血液HIV核酸水平進行持續性檢測，最終證實全球首例功能性治愈的艾滋病患兒。可以看出很多醫學工作者逐步嘗試用dPCR的方法替代原有檢測方法實現更準確高效的診斷，目前商品化的ddPCR已被大量應用于腸病毒，巨細胞病毒，結核桿菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等臨床領域［48-50］。

4.2 拷貝數變異的檢測與鑒定

數字PCR可以絕對定量的特點，使其在鑒定拷貝數變異方面相較于常規的PCR技術具有明顯的優勢，現階段，數字PCR已經在腫瘤相關基因拷貝數變異鑒定方面取得了廣泛的應用。

CNV通常是指DNA部分（包括基因）的重復與缺失，Benjamin等［51］首次應用ddPCR在高通量樣品條件下對二代測序技術進行驗證，此后隨著與NGS等方法的聯用來進行CNV位點的驗證越來越得到認可。目前研究表明劑量的變化會影響基因的表達［52］與表型［53-54］。隨著拷貝數的增加，量化劑量效應變得具有挑戰性，更具準確性的dPCR被采用。Maria等［55］研究唾液淀粉酶基因的高度多態拷貝數變異體，他們利用ddPCR加轉錄組學的方法分析用于檢測潛在的基因劑量效應（圖11）。發現AMY1拷貝數與淀粉酶的量呈顯著正相關，對降低肥胖風險有顯著影響［56］。也說明了其他形式的DNA變異包括拷貝數變異可能解釋遺傳性的缺失。

Miotke等［57］開發了一種單色熒光dPCR的方法，使用非特異性雙鏈結合染料EvaGreen（EG），通過操縱目標和參照擴增子的長度實現區分它們的熒光信號并獨立量化（圖12）。Miotke等通過檢查原癌基因FLT3中的拷貝數和BRAF中常見的V600Epoint突變來證明這種方法的有效性。擴增子的長度改變導致雙鏈DNA存在的堿基對改變。由于EG染料的熒光幅度與dsDNA存在量成正比，具有較長擴增子的微滴比具有較短擴增子的微滴熒光更明亮。這種檢測方法可以減小投入，提供了商業推廣的可能性。

除了這些比較常見的方法，還有學者開發了具有針對性的測定方法。Taly等［58］開發了一種不同濃度的相同熒光基團反應測定7種突變的多重方法（圖13），結合ddPCR可以實現簡單的格式來篩選多個基因座的可能性。可以通過改變TaqMan探針的濃度和性質來調節終點熒光強度，這使得可以識別和計數含有每個獨特可擴增靶標的液滴。

5 數字PCR在微生物檢測方向的應用

根據世界衛生組織的估計，全世界每年的食源性疾病患者大部分都是由致病微生物引起的，從原材料加工到流通貯藏各個環節都有可能感染，相比于常規的微生物檢測需要繁復的增菌、分離和生物學鑒定，PCR技術更加快速靈敏且特異性強。ddPCR定量檢測食源性微生物是目前發展的一個方向。張永江等［59］根據馬鈴薯S病毒的外殼蛋白基因保守序列設計引物探針；陳嘉茵等［60］采用逆轉錄微滴式數字PCR可以靈敏地檢測出受污染食品中低病毒含量。Rothrock等［61］用ddPCR對商業家禽處理水樣進行沙門氏菌檢測；Bian等［62］對單核細胞增生李斯特菌進行檢測，檢測結果表明方法最低檢測下限為10 CFU/mL。ddPCR方法在實際應用中有很好的特異性與靈敏度，在食源性微生物中有很大發展空間。qPCR在炭疽桿菌質粒拷貝數檢測中差異很大［63-64］。Straub等［65］采用 ddPCR 對炭疽桿菌質粒pXO1和pXO2進行了拷貝數測定。將qPCR與ddPCR的實驗結果進行對比發現dPCR結果更接近于直接測序數據。

ddPCR還可以實現自然界中多個細菌多個基因的鑒定與分類。Ottesen等［66］用編碼參與白蟻和腸道菌群共生的關鍵酶基因作為實驗鉤，發現幾個未知核糖體RNA并鑒定了復雜環境中攜帶目的基因片段的菌群，Hua等［67］利用ddPCR分析土壤中黃曲霉毒素和無毒黃曲霉菌混合物的群體比率，由于黃曲霉無毒素菌株與產黃曲霉菌菌株具有競爭關系，可用于后續生物防治。

6 數字PCR在非核酸靶標物質中的檢測中的應用

圖11 數字PCR檢測拷貝數［55］

圖12 單色熒光數字PCR檢測方法［57］

圖13 單色熒光多重檢測方法［58］

生物傳感器是一類可以實現不同種類信號之間轉化的裝置，其中核酸傳感器是一類可以將非核酸信號轉化為核酸信號的核酸分子。常見的核酸傳感器包括重金屬核酶傳感器、核酸適配體生物傳感器、電化學生物傳感器等。以重金屬核酸傳感器為例，傳統的重金屬檢測技術通常是基于ICP-MS等大型儀器的，隨著便攜性更強的重金屬傳感器的開發，針對不同重金屬離子的核酸檢測技術已經越來越得到學者們的關注。

許文濤團隊［68-69］結合數字PCR技術與重金屬傳感器，開發了針對銅離子的開型（Turn-on）生物傳感器檢測技術以及汞離子的閉型（Turn-off）生物傳感器檢測體系。該研究以銅離子（Cu2+）和汞離子（Hg2+）為研究對象，通過體系優化，實現了生物傳感器步驟從重金屬離子信號到核酸信號最為高效的轉化（圖14）。后續通過對核酸信號進行數字PCR的絕對定量鑒定以及信號轉化率計算，實現了對兩種重金屬離子的絕對定量。對于兩種重金屬離子，本檢測體系的定量檢測限可以達到500 fmol和40 fmol，定性檢測限達到50 fmol與10 fmol，線性范圍均超過3個數量級。該檢測體系的檢測限以及線性范圍表明該檢測體系可以滿足絕大多數樣品中兩種重金屬離子的檢測需要。

另一方面，為滿足汞離子和銀離子的邏輯門檢測方法的需要，程楠等［70］首次通過數字PCR產生的數字信號建立了一系列的絕對定量邏輯門檢測監測體系（圖15）。由于汞離子和銀離子特殊的生物化學性質，依賴T-Hg-T和C-Ag-C的錯配堿基配對，實現了重金屬信號向核酸信號的轉化。通過進一步的體系優化，實現了對重金屬離子的絕對定量檢測和不同類型邏輯門的設計（YES門、AND門和OR門）。

圖14 基于生物傳感器和數字PCR的銅離子以及汞離子絕對定量檢測體系原理圖

圖15 數字PCR-邏輯門檢測體系基礎反應原理［71］

7 小結

數字PCR技術的廣泛應用逐漸顯現出一些不足之處。首先，相對于常規檢測技術來說，由于數字PCR熒光通道的局限性導致其檢測通量不會很高，這決定了在多樣品多靶標的篩查中，數字PCR技術通常具有較高的工作量；另外，數字PCR較為昂貴的實驗成本也同樣制約了數字PCR的發展；而且，由于數字PCR平臺商業化還沒有特別成熟，所以數字PCR平臺的自動化操作還沒有得到學者們的廣泛關注，同時數字PCR平臺的標準化檢測技術開發的滯后也制約了數字PCR技術在各領域的進一步發展；另一方面，由于現階段數字PCR內部的平臺眾多，各個平臺的數據分析處理方式不盡相同，所以如何對不同數字PCR平臺之間的數據進行規范的協同分析也是數字PCR發展的重點。不過由于數字PCR較于常規檢測技術不可替代的優勢，尤其是在背景復雜的樣品方面［71］，其不斷發展也將對功能核酸檢測領域產生深遠影響，在分子生物學和醫學等基礎研究和應用方面發揮更大的作用。