Mg2+功能核酸生物傳感器檢測技術的研究進展

王聯臻 張倩 李凱 賀萬崇 羅云波， 黃昆侖， 許文濤，

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

鎂元素是人體內必不可少的礦物質元素之一［1］。它是神經肌肉興奮性和細胞通透性的重要激活劑。相較與其他二價金屬離子，Mg2+在細胞內含量最高，在細胞增殖和凋亡過程中也有很重要作用，Mg2+在臨床醫學，營養學和生理學中的應用已經引起人們的廣泛關注［2-3］。目前發展成熟的儀器檢測方法用于檢測Mg2+，具有靈敏度高、快速、取樣量少等特點。雖然這種方法已經形成了一系列的檢測標準，但是仍然存在著儀器設備復雜、價格昂貴等缺點?；诠δ芎怂岬纳飩鞲衅?，作為一種開發的新型檢測技術，具有序列易修飾、特異性高、穩定性高、成本較低和操作簡單等優勢。

功能核酸是具有特異性識別靶標物質和催化功能的核酸序列。功能核酸按照其組成核酸可分為功能型DNA和功能型RNA，按照其功能可分成能與特定目標相結合的核酸適體、具有催化活性的核酶（RNAzyme）和脫氧核酸（DNAzyme）。由于功能核酸的獨特功能，越來越多的研究者將這一特性運用于檢測分析的領域?，F階段，DNAzyme是作為Mg2+最主要的功能核酸生物傳感器。RNAzyme由于在特異性方面還有待提高，目前還未篩選出適用于檢測的Mg2+依賴性RNAzyme。同時比較RNAzyme和DNAzyme，DNAzyme具有容易制備，對于化學降解和酶降解不敏感等優點。DNAzyme的篩選方法是體外篩選，現在還沒有體內篩選的Mg2+依賴性 DNAzyme［4］。8-17 DNAzyme 和 10-23 DNAzyme以及它們的變體是研究最多以及應用最廣泛的兩種DNAzyme。DNAzyme有類似于酶的催化活性［5］，在Mg2+的作用下可以對底物DNA鏈的rA位點切割，DNA鏈斷裂，通過標記熒光基團產生的熒光信號或者是電化學信號的改變對Mg2+或者靶標物質的量進行檢測?；诠δ芎怂岬腗g2+生物傳感器檢測技術已經成功運用于食品和生物醫學方面。本文將介紹Mg2+功能核酸介導的生物傳感器的研究進展。

1 Mg2+與核酸作用規律及作用方式

Mg2+與核酸的結合主要是通過Mg2+與磷酸根和碳基位結合形成金屬離子-核酸復合結構［6］。Mg2+與核酸堿基作用有單配位和雙配位這兩種類型（圖1）。與尿嘧啶和胸腺嘧啶結合是單配位，二者配合方式的Mg2+-O4鍵長度接近，U1-Mg2+和T1-Mg2+中Mg2+-O4-C的親和力值分別為140.9和108.9 kcal/mol。與胞嘧啶通過N4和O2的雙配位結合最為穩定，親和力值為187.1 kcal/mol。在腺嘌呤中，Mg2+主要是與N3和N9的雙配位，親和力值為188.5 kcal/mol。而在鳥嘌呤中，結合方式均為雙配位［7］。鎂離子核酶切割機制主要是RNA底物鏈通過沃森-克里克（Watson-Crick）方式與酶鏈結合，并在位于不成對的嘌呤和配對的嘧啶殘基之間進行特異性切割［4］。

2 Mg2+的DNAzyme篩選方法

DNAzyme性質比較穩定，制備方法較為簡單，可以通過SELEX體外篩選方法來獲得對RNA特異性切割的DNAzyme。SELEX技術的基本原理是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，用它與靶物質混合，混合液中存在靶物質與核酸的復合物，洗掉未與靶物質結合的核酸，分離與靶物質結合的核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，進行下一輪的篩選過程。通過重復的篩選與擴增，一些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗，具有高親和力的DNA從隨機文庫中被分離出來。進行DNA序列的廣泛搜索，在尋找最符合標準的分子需要滿足以下幾個條件：（1）在模擬生理條件下測試多次切割RNA的能力；（2）通過堿基配對識別RNA的能力；（3）改變底物識別區的序列對其他RNA底物泛素化；（4）催化效率達到或者超過RNAzyme不超過50個脫氧核苷酸組成為優［4］。最早通過SELEX體外篩選法篩出的Mg2+DNAzyme是8-17 DNAzyme和10-23 DNAzyme（圖2）。兩者都是有特定堿基構成的催化結構域與兩側底物特異性脫氧核苷酸識別結構域組成，由于分別是第8和第10個循環中第17與第23個克隆產物因此得名8-17與10-23。針對不同靶標序列，通過設計特異性的結合區域，在Mg2+存在情況下實現對靶標的定點切割。

圖1 Mg2+與堿基配位［7］

圖2 8-17 DNAzyme和 10-23 DNAzyme［4］

再之后的研究中又篩選出7S11 DNAzyme、Mg5 DNAzyme、9DB1 DNAzyme、10DM24 DNAzyme 等Mg2+依賴性的脫氧核酶（表1）［8］。

表1 Mg2+依賴性DNAzyme的莖環序列

3 Mg2+核酸變溫擴增生物傳感器檢測技術

Mg2+脫氧核酶介導的生物傳感器可以與傳統PCR擴增技術相結合，通過擴增技術實現信號的放大作用，可以有效的提高檢測限以及準確度。Breaker等［9］通過PCR選擇性擴增出DNAzyme，它具有催化切割RNA的功能。Mg2+作為輔因子，探究了不同鹽濃度、溫度以及識別域堿基種類對于Mg2+依賴性DNAzyme活性影響。Zhou等［10］從含有50個隨機核苷酸的DNA文庫中，分離并通過兩步PCR擴增在血清中的切割序列。經深度測序分析，文庫中80%是8-17 DNAzyme的變體17EV1，17EV1是Mg2+依賴性脫氧核酶，能在血清中發生切割反應（圖 3）。

圖3 Mg2+ DNAzyme介導的血清體外篩選的循環方案［10］

4 Mg2+核酸恒溫擴增生物傳感器檢測技術

等溫核酸擴增技術是一類新型的核酸分析技術，與傳統PCR相比，等溫核酸擴增技術擺脫了對熱循環儀器的需求，并且針對靶標序列的擴增具有耗時短、反應靈敏、特異性高等優點［11］。Mg2+DNAzyme與恒溫擴增結合縮短了檢測時長，為實現現場快檢奠定了基礎。

4.1 滾環擴增技術（Rolling circle amplification，RCA）

滾環擴增技術是繼變溫擴增技術后發展的一種恒溫擴增核酸的技術。以環狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物（與部分環狀模板互補），在酶催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個重復的模板互補片段。Kong等［12］基于RCA的原理，用Mg2+特異性DNAzyme檢測人類8-oxoguanine DNA glycosylase（hOGG1）的活性。探針P1被8-oxoG修飾并插入了Mg2+特異性DNAzyme的反義序列，和探針P2部分互補。加入hOGG1后，蛋白質沿dsDNA移動以尋找8-oxoG。當蛋白質遇到氧化損傷的鳥嘌呤時，它與8-oxoG特異性結合，將oxoG從DNA中剪出，并將其消化。通過hOGG1的AP裂解酶將雜交的dsDNA分成兩部分，產生較短的互補dsDNA和新的5′磷酸化掛鎖探針，加入探針P3后掛鎖探針的兩個末段的位置接近。在Phi29聚合酶和dNTPs存在下，RCA反應生成大量Mg2+特異性DNAzyme。DNAzyme循環切割底物，F和Q分離，熒光信號顯著增強（圖4），此方法檢測限為0.001 U/mL。

圖4 基于靶誘導的自催化DNAzyme產生的滾環擴增的hOGG1 活性測定［12］

Song等［13］建立了基于分枝滾環擴增（RCA）技術對DNA甲基化進行檢測的方法。分枝滾環擴增反應的原理涉及3個主要過程：（1）Dam MTase和DpnI酶聯合反應；（2）分枝RCA；（3）熒光檢測。在第一步中，DNA鏈1和2（S和P）的雜交引入50-GATC-30的回文序列，其作為反應底物并被催化為甲基化的雙鏈DNA（50-G-mA-TC-30），由Dam MTase在S-adenosylmethionine的存在下進行。甲基化的雙鏈DNA通過識別位點被Dpn I切割。在甲基化/裂解反應之后，新產生的ssDNA作為信號引物與環狀模板結合并在DNA聚合酶Klenow片段存在下啟動RCA反應，產生長重復圓形探針序列。此外，引入了發夾DNA，其作為分枝RCA的關鍵元件。環狀DNA包含3個功能序列（紅色，即識別序列為ssDNA；紫色，RCA的樹枝狀分支元素的互補序列；和綠色，Mg2+特異性DNAzyme的識別序列）。發夾DNA由莖區組成，包括ssDNA（S’）序列（與環狀DNA互補）和環狀區域，該環狀區域與環狀DNA的紫色相同。在這些條件下，發夾的紅色序列被阻塞在不活躍的結構中。在ssDNA（S’）和聚合酶/ dNTP存在的情況下，RCA由環狀DNA模板觸發，導致這個過程重復發生。重復的紫色序列與具有發夾結構的單鏈環互補。這種雜交導致發夾的打開，釋放與環形DNA模板結合的ssDNA的游離序列，觸發分枝RCA的發生。環狀模板DNA的主要識別區是由Mg2+特異性DNAzyme序列組成的分枝RCA鏈。最終DNAzyme的大量形成觸發底物的切割，通過產生顯著放大的熒光信號對Dam MTase進行分析（圖5）。其檢測限達到0.36 U/mL，反應時間為2 h。

圖5 分枝滾環擴增誘導的熒光反應［13］

4.2 鏈置換擴增反應

Yin等［14］運用鏈置換擴增反應檢測microRNA。當microRNA-21存在時，用DNA聚合酶誘導的鏈置換擴增反應可以產生一定量的觸發DNA，觸發DNA可以與用生物素和AMCA染料標記的信號DNA進一步雜交。引入Mg2+后，觸發DNA可形成DNAzyme切割信號DNA。磁珠分離后，含有AMCA染料的DNA片段可以產生熒光信號，其檢測限為0.27 fmol/L（圖 6）。

4.3 環介導恒溫擴增技術

環介導恒溫擴增（LAMP）是由Notomi等［15］發明的恒溫擴增技術。LAMP的原理主要分為擴增啟動、循環擴增和延伸循環3個步驟。這項技術的優勢是可在等溫條件下實現擴增、擴增效率高、對目的序列具有高選擇性和擴增產物的檢測方法多樣。Su等［16］設計了特異性引物來靶向S. scitamineum的Pep1基因，采用單因素實驗方法和設計正交實驗，篩選了循環介導等溫擴增（LAMP）反應體系的3個重要組分Mg2+，引物和Bst DNA聚合酶的最適濃度。建立了適用于S. scitamineum檢測的LAMP系統。靈敏度高于常規PCR檢測的100倍。這種新型LAMP系統不僅為甘蔗黑穗病監測提供了技術支持，也為其他植物病原體的相似檢測技術的發展提供了良好的條件。

圖6 生物傳感器制造和microRNA的電化學檢測的示意圖［14］

5 G4介導的Mg2+功能核酸生物傳感器檢測技術

DNA G-四聯體是由單個富含鳥嘌呤的序列或由兩個（二聚體）或四個（四聚體）分開的鏈結合形成的四鏈DNA結構，為二級結構DNA（圖7）。與其他DNA二級結構相比較，G-四聯體的結構特征是它具有更大的方形芳香表面，由4個鳥嘌呤通過氫鍵形成的［17］。

圖7 G-四聯體的不同結構

Lin等［17］將 Mg2+DNAzyme與 G-四聯體結合形成復雜空間結構，Mg2+作用下引導G-四聯體形成產生輸出信號。G-quadruplex DNA的積累是通過G-quartet的π-π堆積形成的，Mg2+的作用是通過Mg-O配位鍵的形成結合配位化合物來中和DNA磷酸骨架的負電荷。因此，DNA可以充分接近，從而更容易發生π-π堆積（圖8）。

圖8 G-四聯體與Mg2+模型［17］

Elbaz等［18］通過核酸結構的協同自組裝來活化DNAzyme級聯，作為構建自組裝核酸來分析靶標DNA和DNA擴增感應的方法。構建自組裝核酸來分析靶標DNA。核酸2、3與靶標物質兩段互補。核酸4被序列5阻塞成一個準圓形結構。在靶標DNA存在時，它們自組裝形成超分子結構。序列2、3與靶標DNA雜交可以協同使序列2、3與4的雙鏈體結構穩定。當Mg2+存在時，發生切割反應。序列4、5連接處遇熱不穩定，所以產生兩條單鏈核酸（圖9）。加入氯化血紅素使之解離成兩個辣根過氧化物酶模擬的DNAzyme，催化H2O2氧化ABTS2-形成有色的ABTS-。

圖9 核酸結構自組裝，通過DNAzyme級聯分析DNA［18］

6 納米材料介導的Mg2+功能核酸生物傳感器檢測技術

近年來，納米技術以及納米材料發展迅速，尤其是納米材料與其他材料的聯用。納米材料與生物傳感器聯用，可以增加生物活性的固定量、表面活性位點，提供良好的反應環境，加快電子傳遞過程，縮短信號的響應時間，從而使生物傳感器的靈敏度、檢測范圍、重復性得到明顯的增強。同時納米技術多領域的交叉融合，還能拓寬生物傳感器的應用范圍［19-20］。

6.1 金納米粒子

Chen等［21］構建DNA馬達用于檢測蛋白質（圖10）。DNA馬達由Mg2+依賴性DNAzyme，AuNP和底物3部分組成。AuNP作為支架構成底物分子的三維軌道，底物的高密度增強了DNAzyme在三維軌道的移動。當加入靶蛋白質并和配體結合后，激活了馬達系統。再加入Mg2+，發生了切割反應。熒光基團釋放，根據熒光的變化來檢測蛋白質的量。同時DNAzyme分離并與另一個底物雜交。此方法實現了DNAzyme沿AuNP的自主移動，對凝血酶的檢測限達到5 pmol/L，檢測時間為120 min。

6.2 碳基納米材料

Yun等［22］設計了一個基于DNAzyme的分枝連接結構，用來同時檢測Mg2+、Cu2+和Pb2+（圖11）。所有的DNA序列都由不同DNAzyme的E-DNA鏈和S-DNA鏈組成，將3個不同的熒光基團分別標記在E-DNA的末段。3個DNA序列之間部分存在互補關系，使之相互雜交形成分枝連接結構。沒有靶標金屬離子時，主要通過dsDNA與氧化石墨烯連接，分枝連接結構的DNAzyme熒光信號較強。在靶標金屬離子存在時，S-DNA的rA位點被切割，被切割的S-DNA片段被釋放，與氧化石墨烯通過π-π堆積的形式結合，熒光信號顯著淬滅。這種方法能同時檢測3種金屬離子，檢測時間25 min，且Mg2+檢測限達到200 nmol/L。DNAzyme和氧化石墨烯結合具有很好的水溶性，生物相容性以及優異的熒光淬滅能力。

6.3 硅基納米材料

Balogh等［23］研究了使用DNAzyme封裝的介孔二氧化硅納米粒子合成點擊化學產物。Cy3-DBCO（DBCO =二苯并環辛基）和Cy5-N3作為反應物，分別封裝在含Mg2+依賴性DNAzyme和Zn2+依賴性DNAzyme的MP SiO2納米粒子。在Mg2+和Zn2+作為觸發劑的情況下，納米粒子被解鎖，Cy3-DBCO和Cy5-N3從容器中釋放出來，形成點擊產物Cy3-Cy5。根據熒光變化進行測定（圖12）。

6.4 生物納米材料

Jin等［24］提出了一種基于DNA納米花（DNFs）的新型可生物降解的癌癥治療系統，用于靶向雙基因沉默的方法。通過復制滾環擴增模板構建治療系統，以產生具有細胞靶向和雙重基因沉默能力的長單鏈DNA。DNFs的結構在酸性pH下崩解，由共組裝的焦磷酸鎂分解產生的Mg2+作為DNAzyme的輔因子，并增加其識別和切割靶mRNA的能力。體外和體內研究表明，多功能DNFs有望用于靶向癌細胞識別，基因沉默，誘導凋亡和抑制腫瘤生長?？紤]到該治療平臺的治療效果和生物相容性的增強，可能對癌癥的臨床治療具有重要意義。

圖10 基于AuNP的DNAzyme馬達檢測蛋白質［21］

圖11 基于氧化石墨烯同時檢測Mg2+，Cu2+和Pb2+［22］

7 Mg2+功能核酸電化學生物傳感器檢測技術

基于電化學檢測的DNA電化學生物傳感器是從20世紀90年代發展起來的一種新的傳感器技術。它的基本結構包括一個能固定DNA探針的電極和一個換能器。這種傳感器具有簡單、快速、無毒、成本低、靈敏度高和可用于活體檢測等優勢［25］。

Gao等［26］已經開發了基于Mg2+的DNAzyme的電化學生物傳感器，可用于檢測血液中的Mg2+含量（圖13）。將5’端有硫醇的Mg2+特異性DNAzyme通過thiol-Au相互作用固定在金電極上，5’端由結合二茂鐵（Fc）的DNA底物鏈通過與DNAzyme雜交連接到金電極。在沒有Mg2+的情況下，表現出二茂鐵的電流；當Mg2+存在時，結合二茂鐵的DNA底物鏈被DNAzyme切割成兩段并遠離電極，電流減少，電流隨Mg2+濃度增加而減少。這種傳感器有很高的特異性，能免受其他二價金屬離子的干擾，其檢測限達到0.05 mmol/L。

8 Mg2+功能核酸在食品中三聚氰胺的應用

Wang等［27］基于三聚氰胺（Melamine）結合觸發的三鏈體形成和Mg2+依賴性DNAzyme，提出了一種新的DNAzyme調控機制，用于三聚氰胺的識別（圖14）。在底物鏈的兩端修飾熒光基團和淬滅基團，在發夾環加入兩個poly（dT）片段，用于特異性結合Mg2+。發夾環的結構域擴大，但DNAzyme的活性結構未形成。然后通過堿基配對，再將有AP位點的poly（dA）引入。加入的poly（dA）因為親和力不足，所以不能形成穩定的三鏈體。當Melamine加入位于poly（dA）的AP位點，通過T-melamine-T連接到核堿基上。DNAzyme的活性結構恢復，在Mg2+的催化作用下發生切割反應，產生熒光信號。

圖12 載有不同分子的DNAzyme封裝的MP SiO2納米粒子［23］

圖13 檢測Mg2+的生物傳感器［26］

除此之外，Liu等［28］也開發了一種新型熒光生物傳感檢測方法（圖15）。TAP由4個結構域組成，其中結構域I的堿基序列與DNAzyme互補。TAP與DNAzyme雜交抑制以抑制催化活性，在三聚氰胺存在下，3個結構域可通過胸腺嘧啶和三聚氰胺之間的氫鍵作用將三聚氰胺結合到AP位點形成三鏈DNA結構。同時，三鏈結構的形成使得Fuel鏈接近TAP-DNAzyme復合物，啟動鏈置換反應輸出復合物和游離DNAzyme。游離的DNAzyme與Mg2+特異性結合催化切割反應，熒光基團和淬滅基團分離，產生顯著的熒光信號。在最佳條件下，三聚氰胺的檢測限在0.9 nmol/L。

圖14 由Melamine形成的三聚體激活Mg2+特異性的DNAzyme［27］

圖15 熒光測定敏感三聚氰胺的原理［28］

9 Mg2+功能核酸在生物醫學中的應用

9.1 檢測血清中的Mg2+

血清中的Mg2+濃度為1.1 mmol/L，在細胞中是1.6 mmol/L。Zhou等［10］對8-17E進行體外篩選，分離并擴增可以在血清中發生切割反應的DNA序列，篩選出8-17EV1和8-17EV2。它在未稀釋的人體血清中的檢測限為1.1 mmol/L，檢測時間為20 min。

9.2 生物成像

Yang等［29］開發了基于AuNP的發夾鎖定的DNA探針，來感知活細胞的miRNA的技術。它是由AuNP和發夾鎖定的DNAzyme組成。在靶標miRNA不存在時，發夾鎖定的DNAzyme鏈通過分子內雜交形成發夾結構，限制DNAzyme的催化活性，熒光被AuNP淬滅。當靶標miRNA存在時，靶標和探針雜交能打開發夾，形成活性二級結構，在Mg2+的輔助下進行切割反應。切割的片段分離，熒光基團被釋放熒光顯著增強。同時，靶標也會被釋放連接到下一個DNAzyme開始另一個循環。這種方法的檢測限達到25 pmol/L。

9.3 生物醫學中的其他研究

Romanova等［30］分析Mg2+在粘質沙雷氏菌核酸酶對RNA的消化活性的作用機制，發現這種機制與DNA酶上的金屬作用機制相似，并且Mg2+的加入既影響酶與底物復合物的產物解離速率，也影響酶與底物的結合。Binase具有選擇性的抗腫瘤作用，可誘導肺癌A549細胞凋亡。它是一種核酸內切酶，可以裂解相鄰核苷酸的苷酸的3′-脒基殘基和5′-OH殘基之間的磷酸二酯鍵，在催化反應的第一階段形成相應的中間體2′，3′-cGMP。加入Mg2+可以提高形成2′，3′-cGMP的水平。在細胞內，有助于肺癌A549細胞的凋亡［32］。

Wei等［32］通過充分利用PLA，MNAzyme和基于GNPs的比色法，成功設計了蛋白質測定方法（圖16）。該方法由PDGF-BB，聚T間隔物，短莖序列和部分MNAzyme的適體組成。同時linker序列被設計為包含MNAzyme的底物序列，可以被切割成兩個片段然后釋放。在靶標缺失的情況下，由于熔解溫度低（Tm ＜25℃），兩個短莖序列在室溫下不能雜交。在靶蛋白存在的情況下，通過兩種探針同步識別一種PDGF-BB然后依次催化切割，生成的碎片不能將GNP-1與GNP-2交聯。因此仍為紅色，檢測限為1 pg/mL。該方法具有更高的成本效益和熱穩定性，且可以擴展用于檢測具有兩個或更多配體的其他分析物的通用方法。

Zhang等［33］將熒光染料亞甲基藍（MB）通過Mg2+依賴性DNAzyme封裝在介孔二氧化硅（MSN）的孔中。在Mg2+存在下，發生特異性切割，MB從孔內釋放出來。這種方法對于未來納米材料釋放藥物具有重要的借鑒意義。

圖16 PDGF-BB的檢測原理圖［33］

10 結語

綜上所述，Mg2+功能核酸的生物傳感檢測技術具有高效、穩定等特點，可以把金屬檢測的問題轉化為核酸的問題，利用核酸來解決問題。同時功能核酸的生物傳感技術為檢測Mg2+提供了新的思路。Mg2+依賴性DNAzyme涉及到多個方面，還需要開展更多的研究。目前主要存在的問題在于3個方面，首先Mg2+相比于其他二價金屬離子，DNAzyme不具有突出的特異性；其次是這項技術的檢測限低于傳統方法的檢測限；最后是成功的實際應用較少。所以在未來的研究中，需要對已知的DNAzyme序列近一步優化或者是另外篩選出特異性更好的DNAzyme，有望在食品方面對更多的物質進行檢測，在生物醫學方面發現更多的作用來促進疾病的治療。現階段，納米材料因為五大效應受到越來越廣泛的關注。在未來，將納米材料和Mg2+功能核酸的生物傳感檢測技術相結合，可以使其靈敏度、檢測限和響應范圍等性能指標得到更大的提升。