外切酶III介導的功能核酸生物傳感器研究進展

宋歡 羅云波 許文濤

（1. 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

在傳統生物學的概念中，DNA的主要功能是儲存遺傳信息。然而早在1982年，Seeman［1］就提出，DNA所特有的分子識別性質或許可以用于完全非生物的環境中。人們從1990年開始對包括適配體和Ribozyme在內的功能核酸進行研究和探索［2］。從此，功能核酸成為感知應用領域中極具吸引力的檢測工具，可源于自然，或是通過隨機的核酸庫人工篩選出來［3］。功能核酸作為靶物質的識別分子，與信號轉換和輸出系統構成生物傳感器的3大組成要素［4］。與傳統的分析方法相比，功能核酸生物傳感器因其靈敏度高、選擇性好、所需時間短、操作簡單和檢測成本低等特點，極大地推動了醫學臨床診斷、環境監測和藥物篩選的發展。

近年來，為了實現超靈敏檢測，人們將不同的信號放大策略整合到傳感器的設計中，包括連接酶鏈式反應［5］、雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction，HCR）［6］、滾環擴增（Rolling circle amplification，RCA）［7］、鏈置換反應［8］和酶催化反應［9］等。盡管這些技術的運用能夠將傳感器的靈敏性提高到一定程度，但也免不了存在些不足，如靈敏性有限、程序繁瑣等。但是，工具酶的高靈敏性和特異性、操作簡單以及反應條件溫和的特性能很好的彌補這些不足，其介導的信號放大技術在生化分析中得到了快速發展，這些工具酶包括序列依賴的限制性內切酶、切刻酶，以及非序列依賴的RNase H、外切酶、雙鏈特異性核酸酶、AP（Apurinic/apyrimidinic，脫嘌呤/脫嘧啶）內切酶和DNase I等［10］。尤其是Exo III，作為一種不需要特殊識別位點，并且有著高效穩定的切割活性的核酸酶，已經被廣泛用于靶物質的信號循環放大過程。Exo III的最佳底物是dsDNA平末端或3′凹端，對ssDNA和3′端含有4個以上單核苷酸凸起的dsDNA活性很低，早期被用于DNA測序［11-12］，后來隨著功能核酸生物傳感器的不斷發展，將Exo III與功能核酸搭配使用，可將非核酸信號轉換成核酸信號，搭載各種信號輸出和放大方式，實現靶物質的快速精準檢測。因此，Exo III在功能核酸生物傳感器的研究應用中占據十分重要的地位。本文對Exo III的不同性質進行介紹，并根據靶物質不同對Exo III介導的生物傳感器進行分類綜述。此外，還對Exo III結合其他信號放大策略或納米材料的生物傳感器進行較為詳細的介紹，旨在使人們更多地了解Exo III在生物傳感器中的應用特點和發展現狀，為今后所用。

1 Exo III與核酸相互作用的酶活性質

Exo III是分子量為28 kD的單體蛋白質，沉降系數（S20，w）為 2.92并且是球形的（f/fo = 1.15）［13］。Mol等［14］報道了Exo III的1.7 A高分辨率晶體結構，該結構具有2倍對稱、4層αβ折疊結構，與DNase I和RNase H的結構有相似之處。Exo III可以催化dsDNA中幾種磷酯鍵的水解，包括3′-5′外切酶活性、3′磷酸酶活性和AP內切酶活性（圖1）。另外，還具有RNase H活性。下面將對這幾種主要的活性進行較為詳細的介紹。

1.1 磷酸酶活性

Exo III在大腸桿菌中被大量純化，最開始被鑒定為一種磷酸酶。在磷酸鉀緩沖液中，Exo III發揮磷酸酶活性的最佳pH為6.8-7.4；在Tris-馬來酸鹽緩沖液中，最佳pH為6.7-7.0，兩種緩沖液達最大磷酸酶活性的pH均為7左右［15］。此外，Mg2+對Exo III磷酸酶的活性具有十分重要的作用，在缺少Mg2+的條件下，磷酸酶活性只達最大酶活的5%，其他二價陽離子如Ca2+和Zn2+無法取代Mg2+的作用；且當Mg2+處于濃度最優時，Zn2+的添加會導致磷酸酶的酶活抑制［15］。Richardson 等［16］證明 Exo III只有將dsDNA的3′磷酸基團移除之后，才能從3′端逐步釋放出5′核苷酸，發揮外切酶的活性。

1.2 外切酶活性

Exo III對dsDNA具有水解專一性，當dsDNA存在時，Exo III催化dsDNA分子從3′末端進行逐步水解［16］。該酶的最適底物為平末端或者3′凹端的dsDNA［17］。在消化過程中，部分水解的dsDNA產生凸出的5′尾巴，雙鏈區域會越來越短，直到沒有足夠的堿基數量維持堿基對以保持雙鏈結構。由于ssDNA鏈內存在氫鍵，所以Exo III對ssDNA也具有一定的降解作用，但降解效率遠低于dsDNA［18］。在dsDNA消化40%-50%之后，由于剩余的DNA幾乎都是單鏈的，因此水解速率會突然減緩［18］。Wu等［19］證明，在23℃時，一個Exo III分子在10 min內能夠從DNA的3′端水解100個核苷酸。5℃時，在高鹽環境中，一個Exo III只能催化一個dsDNA分子的3′端約6個核苷酸同步水解；若Exo III與dsDNA分子3′端之比提高到2倍時，每個3′末端將有約12個核苷酸水解［20］。

當合成雙鏈由均聚物如（dA）n·（dT）n 或交替共聚物如d（A-T）n組成時，此時相關的動力學與天然來源的DNA不同，因其會通過氫鍵的自發斷裂和重組使鏈在彼此之間移動，從而維持最大限度的堿基配對，直到底物被消化的程度接近100%［18］。

1.3 內切酶活性

DNA的烷基化主要發生在鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3位，在中性或酸性環境中，DNA會因為失去烷基化的鳥嘌呤殘基導致單鏈斷開［21］。1969年，Friedberg 和 Goldthwait［22］純化出內切酶 II，該酶不僅能夠降解烷基化的DNA，對天然的T4和T7噬菌體DNA還能夠造成有限的單鏈斷裂［23］。此外，在高純度的內切酶II樣品中還發現了外切酶活性，但當時被誤認為是受到外切酶污染的緣故［22］。Yajko和Weiss［24］發現，Exo III缺陷型的大腸桿菌突變體，其內切酶II的活性也同樣受到影響，反之亦然，即Exo III和內切酶II的活性具有一定的相關性。隨后Weiss將純化好的內切酶II樣品分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、蔗糖密度梯度離心和凝膠過濾層析，發現每個實驗中，只要是含有內切酶II活性的部分都同樣包含外切酶和DNA-3′-磷酸酶活性，這些活性均來自同一個單體蛋白Exo III，可能是因為該蛋白的某個活性位點能夠通過脫嘌呤或DNA雙鏈自發的末端解旋從而識別鏈間區域［13］。

1.4 RNase H活性［18］

將Exo III的純化產物進行凝膠過濾時，無法將RNase的活性與Exo III的其他酶活區分開。Poly（rA）·poly（dT）的降解速率是 poly（dA）·poly（dT）的1/5。雜交鏈中RNA鏈的降解比DNA鏈快100倍，同時缺少任何一條鏈，將無法從另一條鏈檢測出酶活，這種現象可能是由于Exo III識別與切割鏈互補的DNA鏈上的脫氧核糖殘基。

圖1 Exo III對dsDNA的作用類型［18］

2 Exo III介導的功能核酸生物傳感器

由于Exo III的最佳底物是dsDNA平末端或3′凹端，對ssDNA和3′端含有4個以上單核苷酸凸起的dsDNA活性很低，所以在傳感器發生酶催化反應時，為了保證靶物質的完整性，信號探針參與雜交后應為平末端或 3′凹端［10］。

2.1 Exo III介導的microRNA功能核酸生物傳感器的研究進展

研究表明，microRNAs可以成為某些疾病如惡性腫瘤的生物標志物，microRNAs的表達與腫瘤的發生、發展和治療反應等具有緊密的聯系，因此檢測腫瘤細胞的microRNAs對于癌癥的機制探索、控制和治療具有很重要的意義［25］。Huang等［26］利用Exo III和石墨烯介導的信號放大體系設計了一個檢測microRNAs的生物傳感器（圖2-A）。miRNA-34a與probe DNA互補雜交成pDNA/miRNA-34a，之后Exo III將probe DNA消化成短的寡核苷酸片段，同時釋放出的miRNA-34a再與完整的probe DNA雜交參與信號放大過程，而這些短的寡核苷酸（1-4 mer）能夠增強石墨烯上羅丹明6G的電離效率，使信號增強，這種方法測得的microRNA濃度能達到fmol/L水平。

Min等［27］根據聚集誘導發光的原理設計了一個具有TPEPy黃色熒光基團的超級耐光DNA探針，對尿液和活細胞中的microRNAs進行了監測（圖2-B）。反應開始時，microRNA 21與探針的DNA部分雜交形成雙鏈DNA-RNA，由于3′為平末端，Exo III對該雙鏈進行識別和切割，釋放出microRNA 21繼續與完整的探針雜交開始下一個循環。即一個microRNA會引起多個循環并釋放出許多疏水的TPEPy，聚集在一起產生黃色熒光，檢測限為1 pmol/L。將FAM/Cy3及其相應的淬滅基團作為對照，同樣可以進行microRNAs的檢測，但是由于熒光漂白現象，這種方法并不適合長期的細胞示蹤。

2.2 Exo III介導的DNA功能核酸生物傳感器的研究進展

Cai等［28］利用兩個3′端凸出的P1、P2分子信標進行Exo III介導的雙重循環放大反應來檢測人血色素沉著癥基因（T）（圖3-A）。由于這兩個分子信標P1和P2為3′端凸出，可抵抗Exo III的消化，因此可在Exo III條件下穩定存在，背景信號低。T存在時，先與P1雜交形成雙鏈，由于TP1雙鏈中P1為平末端，因此其3′端被Exo III部分消化，釋放出T和X。由于Exo III對單鏈T有很弱的消化活性，因此這一步的放大反應會一直持續到所有的T被緩慢降解完，此時已經積累大量的X。X的設計比較特殊，可以抵抗住Exo III的消化。P2兩端修飾了熒光和淬滅基團，由于P2的發夾結構，處于熒光淬滅狀態。當與X雜交時，發夾打開，熒光增強，雙鏈中的P2產生了3′凹端，被Exo III消化，而X可以循環消化P2，導致很強的放大反應。根據DNA濃度與熒光信號的關系，可對T進行定量檢測，最低檢測限達0.3 pmol/L DNA。Zuo等［29］也利用5′端修飾熒光基團，分子內部修飾淬滅基團的分子信標對DNA進行了檢測。

圖2 利用Exo III介導的信號放大策略檢測microRNAs

Huang等［30］將Exo III介導的靶物質循環和鳥嘌呤納米線的信號放大方法進行巧妙結合，對人體免疫缺損病毒（即艾滋病毒HIV）基因進行電化學檢測（圖3-B）。當靶DNA存在的時候，會與HP1雜交生成平末端，引發Exo III的消化，釋放出靶基因進入Exo III介導的消化循環。每個消化循環都會得到一個help DNA產物，該產物與HP2雜交能夠將HP2的富G區域c-myc釋放，在K+存在情況下形成平行的G-四鏈體（G4）結構。由于Mg2+能夠識別和促發G4序列沉淀并且形成高聚物結構［31］，因此最后一步加入c-myc和Mg2+孵育可產生鳥嘌呤納米線，與氯高鐵血紅素（Hemin）形成復合物，催化H2O2氧化四甲基聯苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine，TMB），可觀察到電化學信號的增強，檢測限為3.6 pmol/L。Chen等［32］也報道了一種利用Exo III檢測HIV基因的生物傳感器（圖3-C）。首先將DNA探針的3′端修飾了羧基四甲基羅丹明（Carboxytetramethyl rhodamine，TAMRA），與此同時為了與上轉換納米顆粒（Upconversion nanoparticles，UCNPs）表面的羧基可以共價結合，在其5′端修飾了氨基。當靶DNA與標記了TAMRA的DNA探針雜交時，Exo III識別并降解dsDNA，釋放出靶DNA繼續該循環，同時釋放出游離TAMRA。事實上，UCNPs只有與完整的含TAMRA標簽的DNA探針共價結合，才會發生從UCNPs到TAMRA的能量共振轉移，由此對HIV基因進行檢測，檢測限為15 pmol/L。Luo等［33］還利用Exo III介導的循環放大優勢對編碼腸桿菌β-半乳糖苷酶的Lac Z基因進行檢測，最低檢測限為8.7 fmol/L。

2.3 Exo III介導的金屬離子功能核酸生物傳感器

Zhang等［34］采用 Fe3+/ZnO-Ag光催化劑結合Exo III建立了一種靈敏的光電化學傳感器來檢測Hg2+的濃度（圖4-A）。Fe3+/ZnO-Ag在可見光照射下能夠提供光電流。加入Hg2+后，根據T-Hg2+-T的原理可以使發夾DNA形成平末端供Exo III發揮切割功能，切割后釋放的Hg2+重新與3′凸起端的發夾結合進入循環；而切割后產物暴露出的G4序列與hemin組成復合物hemin/G4作為DNAzyme發揮活性，使4-氯-1-萘酚（4-CN）被氧化為不溶物苯基-4-氯己二烯并沉積在電極表面，阻隔界面電子傳遞過程從而影響系統光電流。基于此生物催化沉積法，可以實現對Hg2+的光電化學法檢測，線性范圍是0.5-100 nmol/L，檢測限是 0.1 nmol/L。Gan等［35］也根據T-Hg2+-T與Exo III介導的循環信號放大組合設計了一個電化學傳感器，最后利用［Ru（NH3）6］3+與DNA骨架的靜電作用力特異性檢測Hg2+的濃度，檢測限低至1 pmol/L。

圖3 利用Exo III介導的信號放大策略檢測DNAs

圖4 利用Exo III介導的信號放大策略檢測金屬離子

Hong等［36］采用Exo III和金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs），設計了一種基于DNA構象變化的比色傳感器（圖4-B）。無Hg2+時，發夾DNA（H-DNA）結合到AuNPs上，使其能夠在高離子濃度的溶液中穩定存在。Hg2+存在時，由于T-Hg2+-T的原理，H-DNA的凸出端會完全形成3′平末端，Exo III則開始從H-DNA的3′端逐步移除單核苷酸，于是Hg2+被釋放繼續進行循環反應。H-DNA被降解后可形成穩定的G4結構，此時AuNPs在高離子濃度的環境中發生聚集，導致顏色由紅變藍。該方法的線性檢測范圍為10 pmol/L-100 nmol/L，檢測限低至3.2 pmol/L。

2.4 Exo III介導的蛋白質功能核酸生物傳感器

凝血酶不僅是止血和凝血過程中很重要的絲氨酸蛋白酶，而且還是一種指示腫瘤生長和轉移的生物標志物［37-38］。Yang等［39］利用凝血酶的適配體發明了一種“DNA多重開關”的電化學傳感器以檢測凝血酶（圖5-A）。第一步，先將雙鏈 S1/S2 組裝到金電極表面，之后S1的部分序列會與凝血酶的適配體（TBA）雜交產生新的dsDNA（S1/S2-TBA）。該dsDNA具有3′凸起端，能夠抵抗Exo III的消化。作為電化學發光指示劑，Ru（phen）32+能有效插入到雙鏈中產生強烈的電化學信號。第二步，加入凝血酶后，與TBA結合形成TBA-凝血酶的復合物，釋放TBA，導致電極表面固定的雙鏈由3′端凸起變成凹陷，產生了Exo III的切割位點，之后Exo III消化了S2的紅色部分序列，因此藍色序列S2*得到釋放。由于釋放的S2*與TBA存在部分互補，因此S2*與TBA進一步雜交，使S1/S2-TBA由3′端凸起變成S1/S2/S2*-TBA平末端，Exo III又能發揮降解作用，降解TBA和S2的紅色序列，導致更多S2*的釋放。釋放的S2*再次與TBA雜交，不斷啟動dsDNA的循環降解，這將大大減少Ru（phen）2+3的插入，抑制電化學發光效應。這種由Exo III介導的dsDNA循環對凝血酶的檢測具有很高靈敏度，檢測范圍是0.1-200 pmol/L，檢測限是45 fmol/L。Zhao等［40］也將Exo III的信號放大原理運用到檢測凝血酶的生物傳感器中。凝血酶存在時，兩個TBA亞基能自組裝成完整的適配體以識別和結合凝血酶，由此使相連的短雙鏈區域穩定存在，Exo III發揮降解作用，然后借助T4連接酶和銅納米顆粒的性質實現信號檢測，使傳感器表現出較高的靈敏性，檢測范圍是100 fmol/L-1 nmol/L，檢測限為20.3 fmol/L。

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）是一種與肺癌、乳腺癌和結腸癌相關的廣譜腫瘤生物標志物［41］。由于在患病早期，生物標志物的濃度比較低，因此需要可靠的、靈敏度較高的方法對其進行定量檢測［42］。He等［43］首次將 Exo III介導的信號放大策略與“DNA walker”納米機器巧妙結合，開發出一種檢測癌胚抗原的生物傳感器（圖5-B）。H1和H2是可通過自身雜交成莖環的序列，癌胚抗原存在時，會與H1中的適配體部分結合導致H1的構象變化，從莖環結構轉變為CEA@H1復合體結構，暴露出的a、b區域，于是與H2的3′凸出端開始雜交，形成平末端，使Exo III從H2的3′端開始降解，釋放出CEA@H1和walker DNA。CEA@H1將與新的H2結合參與新的循環，而walker DNA則通過與硅微球表面修飾的H3-e*發生作用形成H3@walker DNA，從而暴露i，因此i可與H4的i*雜交引發鏈置換反應最終形成H3@H4@walker DNA三重復合體。由于H3@H4復合體傾向于形成熱力學上最有利的構象，因此walker DNA會被釋放參與下一個反應循環。H3@H4復合體中，k會形成G4結構，與NMM染料結合發出強烈的熒光信號。該傳感器具有很高的靶標特異性，并實現了1.2 pg/mL的低檢測限，線性范圍是10 pg/mL-100 ng/mL。

Lu等［44］先將轉錄因子NF-κB p50的信號轉換成ssDNA信號，再利用Exo III對該ssDNA進行循環信號放大，對NF-κB p50進行檢測（圖5-C）。首先，ON1和ON2雜交形成dsDNA，且包括了一段NF-κB p50識別位點。不存在NF-κB p50時，由于dsDNA為平末端因此會被Exo III完全降解，無法產生后續反應。存在NF-κB p50時，它會結合到dsDNA上，保護ON2的3′端抵抗Exo III的降解，而由于ON1的3′端沒有保護，因此被降解，從而釋放出ON3。以上屬于NF-κB p50到ssDNA的信號轉換部分。修飾亞甲藍的ON4能夠與ON3雜交，并在Exo III的作用下開啟循環反應。NF-κB p50的檢測范圍是10-5 000 pmol/L，檢測限是 10 pmol/L。Li等［45］還使用了銀納米簇分子信標（AgMBs）的特點設計了熒光開關，同時利用Exo III的切割和信號循環性質，對多種轉錄因子進行定量分析。除了用Exo III檢測凝血酶、抗原和轉錄因子外，Yang和Gao［46］還將AuNPs的聚沉性質與Exo III聯合使用，設計了一種檢測葉酸受體的可視生物傳感器。

2.5 Exo III介導的酶活檢測功能核酸生物傳感器

Xue等［47］將DNA固定在磁珠上，協同Exo III的循環指數放大效應，建立了一種檢測甲基轉移酶（DNA adenine methyltransferase，DAM）活性的熒光磁性生物傳感器（圖6-A）。首先將含有G4序列的單鏈（綠色）與分子信標雜交成dsDNA，組裝在磁珠上（圖6-Aa）。其次，由于發夾探針具有GATC識別位點，因此根據DAM和Dpn I內切酶的性質，聯合使用對發夾探針進行先甲基化再切割，釋放出TSP單鏈（圖6-Ab），雜交到磁珠上的dsDNA，形成平末端，此時Exo III從3′端開始降解，釋放出TSP和新TSP，TSP繼續循環I反應，新TSP進入循環II（圖6-Ac）。這兩種循環的原理類似，且每輪循環后的降解產物即磁珠上殘留的G4序列（綠色），會與ZnPPIX形成ZnPPIX/G4復合物，發出強烈的熒光信號，從而對DAM的酶活進行定量檢測，最低檢測限為 2.0×10-4U/mL。Li等［48］和 Liu 等［49］也同樣利用了DAM和Dpn I的性質，結合電化學或2-氨基嘌呤的熒光特性對DAM的活性進行了測定。

圖5 利用Exo III介導的信號放大策略檢測蛋白質

端粒酶是一種能夠將（TTAGGG）n串聯重復序列添加到染色體末端維持端粒長度的核糖核蛋白［50］。大多數正常的細胞中，端粒酶活性處于抑制狀態，但人類85%癌癥細胞中，端粒酶活性出現上調或者再激活，因此端粒酶活性的檢測對于癌癥診斷，篩選抗癌藥物或者癌癥治療的評估具有十分重要的意義［51-54］。Min等［55］通過點擊反應將疏水的TPE-Py與親水的線性DNA序列連接形成TPE-Py-DNA，作為熒光報告基因（圖6-B）。端粒酶存在時，能夠將重復單元（TTAGGG）n添加到TS primer末端，此延長產物會與TPE-Py-DNA雜交形成dsDNA，隨后被Exo III消化釋放出延長產物和TPE-Py。釋放后的產物會繼續與新的TPE-Py-DNA雜交開始下一個循環，而疏水的TPE-Py將聚集在一起產生與端粒酶活性相關的熒光信號。該方法不僅可以對不同的細胞系進行胞內端粒酶的活性檢查，而且能根據尿液樣品將癌癥病人與正常人區準確地區分開，具有很高的臨床應用價值。除了DAM和端粒酶，還可將Exo III用于T4多聚核苷酸激酶［56-57］和糖苷酶［58］等活性的檢測。

圖6 利用Exo III介導的信號放大策略檢測酶活

2.6 Exo III介導的其他靶物質功能核酸生物傳感器

2012年，Niu等［59］利用一條標記有熒光基團的DNA單鏈發夾探針，通過Exo III介導的信號循環放大反應對可卡因進行了簡單高效的定量檢測。2013年及 2016年，Zhu等［9］和 Zhao等［60］根據ATP依賴的T4連接酶的酶活性質，以及Exo III對底物的切割特性，設計了特異性檢測ATP濃度的簡單、靈敏的生物傳感器，檢測限分別為0.2 nmol/L和 20 pmol/L。2016 年，Ramezani等［61］將 AuNPs淬滅熒光的特性，結合卡那霉素的適配體及其互補鏈，設計了一種Exo III介導的信號循環放大生物傳感器，可對血清和牛奶中的卡那霉素含量進行檢測。Fu等［62］通過3條DNA中的脫堿基位點可特異性識別三聚氰胺的原理，設計了一個由Exo III介導的三聚氰胺生物傳感器，線性范圍是1 nmol/L-0.5 μmol/L，檢測限是0.43 nmol/L。Sun等［63］將正電荷的磁珠與ssDNA通過非共價靜電吸引作用連接在一起，由于致病菌帶有大量負電荷表面，因此與磁珠會發生相互作用，DNA則被取代釋放到溶液中參與Exo III介導的DNA信號放大過程，從而對致病菌實現定量檢測的目的。

3 Exo III與其他信號放大策略相結合的生物傳感器

為了提高生物傳感器的靈敏性，信號放大技術被廣泛運用到傳感器的設計當中，從而提高輸出信號的強度。PCR是最普遍的DNA擴增技術之一，可是PCR有一些限制因素，如需要熱循環和高溫變性［64］。而RCA和HCR屬于等溫技術，不需要熱循環，能夠在更廣闊的領域進行應用。將Exo III與RCA或者HCR相結合的雙重信號放大策略，比單純的一重信號放大具有更強的信號輸出和更高的靈敏性，甚至可以將檢測限降低至amol/L級。

3.1 Exo III與RCA相結合的生物傳感器

RCA是一種利用擴增酶（如phi29、Bst、Klenow等）進行高效等溫擴增的過程［65］。在RCA過程中，聚合酶將單核苷酸持續地添加到與環形模板退火雜交后的引物上，產生具有重復序列的長單鏈，甚至能夠使靶物質的檢測達到一個單分子的水平，并且在溶液［7］、固相載體［66］或者復雜的生理環境中［67］（如細胞表面或者細胞內）均可進行。

Zhou等［68］將Exo III介導的靶標循環體系與RCA技術合二為一，設計出一種具有超高靈敏性的電化學生物傳感器，用來檢測tDNA（即一種與阿爾茨海默病相關的生物標志物）（圖7-A）。先將hDNA通過Au-SH鍵修飾在電極表面，當tDNA與hDNA雜交后，Exo III通過切割hDNA，釋放出tDNA與更多的hDNA雜交、切割及釋放，形成一個往復循環。同時，hDNA被切割后的剩余片段能夠促發RCA，產生大量富G4序列的長鏈，與hemin形成的hemin/G4復合物具有擬過氧化物酶活性并產生電化學信號。這種雙重信號放大的方法具有很高的靈敏性，檢測限為3.3 amol/L。

雙酚A是用于合成聚碳酸酯和環氧樹脂的單體，在人體內具有雌激素的活性［69］。聚碳酸酯和環氧樹脂的應用十分廣泛，可被用作奶瓶、杯子和醫療器械等的原材料。暴露在雙酚A的環境中，可能引發各種疾病包括心血管疾病、癌癥、出生缺陷或者生殖障礙等，即使非常低的含量也會對人體造成危害［70］，因此對雙酚A的定量檢測方法要求具備較高的靈敏性和選擇性。Li等［71］利用抗雙酚A的適配體設計了一種RCA/Exo III級聯放大生物傳感器（圖7-B）。首先，抗雙酚A的適配體（深藍色，用于識別雙酚A）與觸發序列（綠色，用于促發RCA）形成雙鏈DNA。雙酚A存在時，抗雙酚A的適配體會打開構象與雙酚A結合，同時釋放出觸發序列，引發RCA反應，作為初級信號放大。此時，RCA產物在發夾的輔助下促發Exo III介導二級信號放大，累積豐富的燈籠式G4結構與ZnPPIX結合，產生較強的熒光信號，呈現出極高的靈敏度，檢測限為5.4×10-17mol/L。此外，基于Exo III-RCA的信號放大優勢，Xue等［72］對DNA進行了檢測，檢測限為0.51amol；Liu 等［73］對核酸酶 S1（檢測限為 5×10-7U/μL）和ATP（檢測限為5×10-4μmol/L）進行了檢測。

圖7 RCA-Exo III聯用的生物傳感器

3.2 Exo III與HCR相結合的生物傳感器

2004年，Dirks和Pierce首次提出 HCR的概念［74］，這是一種無酶的體外核酸等溫信號放大技術。該技術需要兩條可雜交互補且含有黏性末端的發夾探針，以及引發探針。兩條發夾探針可以穩定存在于溶液中，一旦加入引發探針，就會觸發HCR反應的開始，使兩條發夾探針相繼打開，形成具有多個重復單元的長鏈dsDNA，直到原料耗盡。與其他核酸擴增方法相比，HCR最大的優勢在于無酶參與，為生物傳感器的研究工作提供了很大便利。

Sun等［75］利用HCR、Exo III結合表面增強拉曼 光 譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）的方法設計了一個雙重信號放大的生物傳感器用于心肌梗塞基因的檢測（圖8-A）。靶基因存在時，會打開發夾probe 1互補雜交成dsDNA，Exo III從probe 1的3′平末端開始切割，釋放出靶基因進入下個循環，同時剩余的切割產物作為促發子打開Hp1繼而啟動HCR反應，生成線性長dsDNA。由于Hp1和Hp2末端帶有Tamra標簽，因此可以呈現出具有特征性的SERS指紋信號。此方法實現了1 fmol/L-10 nmol/L的線性關系，檢測限為1 fmol/L。

Yu等［76］不僅利用Exo III和HCR進行雙重信號放大，而且還利用了石墨烯和熒光嵌入劑SYBR GREEN I，建立了一種檢測Hg2+熒光生物傳感器（圖8-B）。首先利用T-Hg2+-T的原理使HP DNA和assisted DNA之間通過鏈置換反應形成dsDNA，隨后Exo III從其3′端平末端開始降解導致Hg2+和assisted DNA循環利用，同時釋放出DNA觸發鏈（Trigger strand），開始HCR形成長鏈雙螺旋結構。SYBR GREEN I可以嵌入剛性dsDNA中發出較強的熒光，而不被石墨烯吸附。通過條件優化，該傳感器對Hg2+的最低檢測限為7.37 pmol/L，線性范圍是0-1.5 nmol/L，并且對Hg2+具有較高的選擇性。Bao等［77］和Xiong等［78］也將Exo III和HCR聯用設計了能夠檢測Hg2+的電化學傳感器。Sun等［79］利用Exo III介導的DNA循環和HCR檢測了腺苷含量。

圖8 HCR-Exo III聯用的生物傳感器

4 Exo III與納米材料相結合的生物傳感器

納米材料指的是由無機或有機材料制備合成，并且在三維空間中至少有一維在100 nm以下的功能材料，由于粒子尺寸非常小，納米材料產生了不同于傳統材料的一些物理、化學特性，如量子尺寸效應和表面效應等［80］。如今各種新型的納米材料得到了大力發展和應用，包括AuNPs、半導體量子點、碳納米管、石墨烯和氧化石墨烯、金屬納米簇、碳點和上轉換納米顆粒等，這些納米材料都可以與適當的分析方法學和檢測技術搭載，設計成多樣化的生物傳感器以檢測生物樣本或者環境污染中的相關靶物質［81］。

AuNPs不僅穩定性高，具有獨特的光學、熱學和較好的生物相容性質，還可與熒光基團發生熒光共振能量轉移成為極強的熒光淬滅劑［82］。Zhao等［83］利用赭曲霉毒素A的適配體，采用Exo III的信號放大手段結合AuNPs的熒光淬滅原理對赭曲霉毒素A進行定量檢測，檢測限低至4.82 nmol/L。AuNPs不僅能夠產生顏色和熒光淬滅效應促進信號轉導，還能夠通過加載大量信號標簽使信號識別產生放大效應，從而提高生物傳感器的靈敏度和特異性。例如，Huang等［84］設計了一種多重標記的電化學生物傳感器，將3種含有不同Redox標簽的信號探針修飾在AuNPs上作為生物條形碼放大策略，與Exo III介導的酶催化反應組成了雙重信號放大系統檢測，可以同時對轉基因樣本中的3種DNA組分進行檢測。

量子點（Quantum dots，QDs）是一種很有前景的熒光納米顆粒，與其他有機染料和熒光蛋白相比，具有熒光強度大、光穩定性高和波長可調的優點［85］。Jie等［85］利用磁珠@Au復合材料的磁性分離特性以及Exo III介導的靶標循環放大策略，使用兩種可區分的CdSe/ZnS和CdTe QDs熒光探針，對miRNA-141和miRNA-21進行了同步熒光檢測，檢測范圍在5 pmol/L-50 nmol/L之間，檢測限是1.5 pmol/L。同年，Jie等［86］在Au-氧化石墨烯納米復合材料修飾電極上逐級組裝CdSe-NH2和CdSe-COOH QDs層，根據雙層QDs與Au@Ag之間的電化學發光能量共振轉移導致電化學信號變化的原理，結合Exo III信號循環放大體系設計了一個檢測凝血酶的生物傳感器。Zhang等［87］通過一步法合成DNA-ZnS：Mn2+量子點，建立了一種以QDs和WS2納米片之間的熒光共振能量轉移為研究基礎的生物傳感器，用于檢測鏈霉親和素。

Wang等［88］將金納米簇/石墨烯（AuNCs/GR）納米雜化物標記上SH-DNA和堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）形成AuNCs/GR-DNA-ALP復合物，作為催化界面。靶DNA引發Exo III循環后產生的切割產物，與金電極上的抓捕探針和AuNCs/GRDNA-ALP中的SH-DNA均部分互補雜交，從而使AuNCs/GR-DNA-ALP固定在電極表面，最終AuNCs/GR-DNA-ALP催化銀沉積反應生成銀納米顆粒產生可檢測的電化學信號。此外，除了本節提到的金納米顆粒、量子點、石墨烯及金納米簇，還有前面提到的銀納米簇分子信標、上轉換納米顆粒等均可與Exo III的信號放大策略相結合，大大提高傳感器的靈敏度和特異性。

5 總結和展望

綜上，Exo III介導的信號放大策略已被廣泛應用于生物傳感器的檢測領域，其最顯著的優勢在于Exo III酶切速度快，能夠在較短的時間內完成信號放大過程；其次，常溫即可反應，活性不易丟失，不需熱啟動步驟；可與各種常見的信號輸出方式（如熒光法、比色法和電化學法等）或其他信號放大方式（RCA或HCR）相結合，以及能夠借助磁珠或者AuNPs等新興納米材料提高檢測效果，具有較好的兼容性。另外，還能夠將不同種類的靶物質均轉換成核酸信號，再進行Exo III介導的信號放大，即不受靶物質種類的約束，這些特點充分滿足了生物傳感器快速、簡便的要求。需要注意的是，Exo III是一種具有多種活性的核酸酶，在使用過程中需要考慮該酶的切割性質，同時溶液中金屬離子的作用可能會影響酶活，盡量避免錯誤切割、酶活受抑制等問題的出現。

目前Exo III介導的生物傳感器主要應用于DNA、蛋白質及小分子物質的檢測，在實際應用方面，偏向于與疾病相關的生物標志物檢測，以及環境中重金屬的檢測等。未來Exo III介導的信號放大策略在生化分析的發展趨勢可能包括以下幾方面：（1）簡便生物傳感器的大量應用：傳感器的設計可繁可簡，最終目的是實際應用，爭取用更短的時間更低的成本實現利益最大化。與復雜的傳感器相比，設計簡單的傳感器不僅節約成本，而且完全可以通過Exo III介導一重或雙重信號放大的方式達到較低的檢測限，為開拓應用市場提供了有利的條件保障。（2）納米材料的多樣化搭載：隨著新型納米材料的不斷更新和應用，使生物傳感器在靈敏度和分析方法的應用方面有很大提升。然而與Exo III搭載的新型納米材料主要集中在石墨烯、金納米顆粒和量子點等，在其他類型納米材料如水凝膠等的應用還有很大空間。（3）胞內檢測：目前由Exo III介導的信號循環放大檢測主要集中在體外實驗，對胞內的檢測雖有文獻報道，但這方面的應用較少，對于臨床診斷來說，胞內檢測和胞內成像無疑將成為未來的研究重點。（4）多重檢測：Exo III價格合理、應用簡便，可通過核酸鏈的精心設計或者多酶聯用，進行多靶標物質的檢測，因此由Exo III介導的多功能生物傳感器或將成為未來的發展方向。（5）不同金屬離子的檢測：目前關于Exo III檢測金屬離子的文獻基本局限于利用T-Hg2+-T的原理來檢測Hg2+，因此對其他金屬離子的檢測還需進一步探索和研究。（6）在病毒、細菌感染以及肉品摻假等實際應用領域將取得更多進展。由此可見，Exo III高效、簡便的特點充分滿足了生物傳感器的檢測需求，具有十分可觀的應用前景。