基于三螺旋核酸的生物傳感器的研究進展

田晶晶 羅云波 許文濤

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

近年來，DNA納米技術迅猛發展。核酸的堿基序列不僅能夠攜帶生物遺傳信息，而且能夠被編輯、設計成各種一維、二維、三維的功能核酸納米器件進行開關調控［1］、邏輯門操作［2］、電路計算［3］與納米機器運轉［4］，在生物成像、體內調控、傳感與檢測領域發揮著重要作用。1957年，科學家Felsenfeld和Davies等［5］發現了多聚嘌呤鏈通過胡思特鍵（Hoogsteen bond）嵌入到雙鏈脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）的大溝中形成三螺旋核酸。近10年來，基于三螺旋核酸的生物傳感技術日新月異地進步，作為DNA納米技術工具箱的重要組成部分，三螺旋核酸傳感平臺在分子成像［6］、配體的攜帶與釋放［7-9］、細胞內表達調控［10］與分析化學［11-16］領域的應用不斷突破，取得了令人矚目的研究進展。

三螺旋核酸（Triplex nucleic acids，TNAs）是在經典的沃森-克里克（Waston-Crick）氫鍵形成的雙鏈核酸基礎上，第三條寡核苷酸鏈以非經典的胡斯特（Hoogsteen）氫鍵嵌入到雙鏈大溝中形成的超分子核酸組裝體。在眾多生物傳感方法中，基于TNAs的生物傳感平臺憑借其快速、靈敏、簡單及可逆等特點而備受關注。本文首先綜述了三螺旋生物傳感器的核酸類別和性質；然后歸納總結了常見的TNAs生物傳感器；論述了TNAs生物傳感器在分子成像、配體的攜帶與釋放、細胞內表達調控與分析化學領域的應用；最后，對TNAs生物傳感器未來的發展方向進行了展望。

1 TNAs生物傳感器的分類、性質與表征

三螺旋核酸是TNAs生物傳感器的結構基礎。按照堿基種類的差異，可將三螺旋核酸分為嘧啶-嘌呤*嘧啶型三螺旋和嘧啶-嘌呤*嘌呤型三螺旋；按照形成方式的不同，可將三螺旋核酸分為分子內三螺旋與分子間三螺旋；按照核酸類型的差別，可將三螺旋核酸分為DNA三螺旋、RNA三螺旋、DNA/RNA三螺旋和PNA三螺旋；按照第三鏈與雙鏈形成三螺旋核酸的方向不同，可將三螺旋核酸分為平行結構和反平行結構兩種類別。

目前，三螺旋核酸的表征方法主要包括：紫外-及可見分光光度法［17］、熒光分析法［18］、原子力顯微鏡觀察法［6］、圓二色譜法［19］及電泳法［20］。鑒于合成生物學的發展，熒光基團標記的熒光探針具有易合成、高靈敏等優勢，熒光分析法逐漸成為表征TNAs生物傳感器的主流方法。

TNAs的形成是制作TNAs生物傳感器的結構基礎。目前TNAs的穩定形成受如下因素影響：（1）pH：酸性條件促進胞嘧啶（cytosine，C）質子化、促進胞嘧啶-鳥嘌呤（guanine，G）*胞嘧啶-（C-G*C）堿基對的穩定形成及促進TNAs的穩定形成；中性條件促進胸腺嘧啶-腺嘌呤（Adenine，A）*胸腺嘧啶-（T-A*T）堿基對的穩定形成、從而促進TNAs的穩定形成［18］；（2）Mg2+：雙鏈核酸是TNAs形成的必要條件，Mg2+通過穩定雙鏈核酸的形成、促進TNAs的形成［21］；（3）Ag+：Ag+通過與 C-G*C 堿基對絡合形成穩定的C-G*C Ag+結構，穩定三螺旋DNA的形成［22］；（4）化合物 ：氯化甲氧檗［13］與二醚二酞酰亞胺化合物［23］發揮類黏合劑樣作用，穩定三螺旋DNA的形成；稠環芳烴的菲與芘，可以作為連接子，連接第三鏈與雙鏈，促進單鏈分子內三螺旋DNA與及異質二聚體間三螺旋DNA的形成［19］。

2 三螺旋生物傳感器

2.1 三螺旋DNA生物傳感器

三螺旋DNA生物傳感器是以DNA鏈構成的核酸三螺旋為結構單元的生物傳感器，占目前已報道的TNAs生物傳感器的大多數，類型多樣且用途廣泛。根據DNA三螺旋的形態差異，將三螺旋DNA生物傳感器分為如下類型。

2.1.1 三鏈DNA三螺旋生物傳感器 三鏈DNA三螺旋生物傳感器是當第三條DNA鏈以Hoogsteen鍵嵌入雙鏈DNA的大溝中形成三鏈DNA組裝體、實現信號輸出的生物傳感器（圖1-A）。2010年，意大利羅馬大學的Francesco Ricci教授團隊利用這種傳感策略，將標記有電化學信號分子（甲基藍）的第三鏈標記在金電極上作為識別元件識別特異的雙鏈DNA靶標，當且僅當雙鏈DNA靶標存在時，靶標DNA與固定化的第三鏈形成三螺旋結構，阻礙甲基藍靠近金電極并轉移電子，實現電化學信號的輸出，實現了雙鏈DNA在復雜血清樣本中特異、靈敏（10nmol/L）的電化學檢測，構建了一種無試劑化、可重復利用的三鏈DNA生物傳感器［24］。但由于利用C-G*C與T-A*T的序列特異性有效識別靶標DNA，使目標DNA的檢測缺乏廣譜性和通用性。

2.1.2 莖環型DNA三螺旋生物傳感器 莖環型DNA三螺旋生物傳感器是從莖環結構的設計獲得靈感，將莖環結構的環狀（Loop）區域改造成具有生物識別作用的單鏈核酸（適配體-aptamer，單鏈DNA等），將莖部（Stem）區域由雙鏈DNA改造成三鏈DNA的結構元件（圖1-B），通過生物識別作用、改變三螺旋的莖環結構、實現信號表征的生物傳感器。2011年，湖南大學譚蔚泓教授［25］團隊設計了一種基于三螺旋莖環結構的生物傳感器，通過aptamer的特征識別機制使三螺旋分子開關發生結構轉換，使第三鏈兩端標記的芘分子靠近、發射高強度熒光，實現了三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）、α-凝血酶（α-thrombin，Tmb）與L-精氨酰胺（LArgininamide，L-Arm）的通用型檢測。2014年，湖南大學王柯敏教授［26］團隊將三螺旋莖環結構搭載電化學傳感平臺，實現了ATP（LOD=60 nmol/L）與Tmb（LOD=4.5 nmol/L）的通用型、超靈敏檢測。2015年，伊朗Khalil Abnous教授［27］團隊設計了一種基于三螺旋莖環結構的傳感平臺，結合金納米粒子的聚沉顯色，實現了四環素的可視化、超靈敏（檢測限，Limit of detection，LOD=266 pM）檢測。通過在莖環型DNA三螺旋生物傳感器的loop區域引入aptamer區域，不僅大大拓寬了三螺旋生物傳感器的檢測范圍，使目標物不再局限于核酸類物質，而且已經發展成為了一種通用型檢測目標物的傳感策略。

2.1.3 夾鉗型DNA三螺旋生物傳感器 夾鉗型DNA三螺旋生物傳感器是以一條具有對稱序列的單鏈DNA為探針，以另外一條DNA為靶標，通過探針DNA鏈與靶標DNA鏈先形成雙鏈、再通過Hoogsteen鍵形成DNA三螺旋的生物傳感器（圖1-C）。在形態方面，夾鉗型DNA三螺旋與莖環型DNA三螺旋相比，loop區域只起到連接作用和非生物識別作用，發揮識別功能的是探針DNA鏈一端的對稱序列。在識別特性方面，由于Waston-Crick鍵與Hoogsteen共同發揮夾鉗狀的特征識別作用，使夾鉗型DNA三螺旋傳感元件具有更強的靈敏度與更優的特異性［11］。2014年，羅馬大學Francesco Ricci教授團隊將夾鉗型DNA三螺旋傳感元件與電化學檢測平臺結合，實現了有效的DNA單堿基錯配區分［28］。

2.1.4 單鏈DNA三螺旋生物傳感器 單鏈DNA三螺旋生物傳感器是由一條DNA鏈先形成Waston-Crick鍵、再形成Hoogsteen鍵的分子內三螺旋DNA生物傳感器（圖1-D）。2014年，Francesco Ricci教授團隊利用雙熒光基團標記的分子內三螺旋DNA，實現了跨5.5個pH單位（pH5.5-11.0）的傳感檢測［18］。目前的單鏈DNA三螺旋生物傳感器主要通過核酸三螺旋的特征序列進行靶標的特異性識別。與夾鉗狀DNA三螺旋生物傳感器相比，由單鏈DNA構成的三螺旋生物傳感器提高了DNA超分子組裝體的結合效率、避免了分子間形成非三螺旋核酸的可能性，進而提高了傳感器的檢測性能。

2.2 三螺旋RNA傳感器

三螺旋RNA生物傳感器是以RNA鏈構成的核酸三螺旋為結構單元的生物傳感器。2016年，哈佛-麻省理工健康科技聯合中心的Natalie Artzi教授 團 隊 利 用 U-A*U、C-G*U、A-U*A、U-G*U和U-G*C等三螺旋堿基對，設計了一種基于三鏈RNA的雙色熒光三螺旋傳感器，該三螺旋RNA能夠識別癌細胞內micro RNA（miRNA），發揮抑制癌細胞miRNA-221與替換癌細胞miRNA-205的雙重功能［10］，拓寬了三螺旋核酸的應用領域，使研究者對三螺旋核酸的研究不再局限于DNA三螺旋。

圖1 三螺旋DNA生物傳感器的4種類型

2.3 三螺旋DNA/RNA生物傳感器

三螺旋DNA/RNA生物傳感器是以RNA鏈為第三鏈嵌入到雙鏈DNA大溝中、形成三螺旋結構單元的生物傳感器。1996年，Ekambar Kandimalla教授和Agrawal教授［29］合作研究了DNA/RNA三螺旋結構，發現以T-A*U堿基對替代T-A*T堿基對形成的三螺旋結構，在相同pH條件下，Tm值比對應的T-A*T三螺旋結構低10℃左右，表明DNA/RNA三螺旋結構不穩定。因此，基于DNA/RNA的三螺旋生物傳感器鮮有報道。

2.4 三螺旋PNA/DNA生物傳感器

肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。三螺旋PNA/DNA生物傳感器是以PNA與DNA雜交形成的核酸三螺旋為基本結構單元的生物傳感器。由于PNA與DNA的結合具有更強的親和性，因此PNA/DNA三螺旋具有更高的特異性、靈敏度及穩定性；其信號的特征識別機制主要包括三螺旋核酸的序列特異性識別、引入與目標物特異性親和的loop區域兩種方式實現。目前根據雜交鏈的類型不同，三螺旋PNA/DNA生物傳感器可分為以下類型。

2.4.1 PNA-DNA-PNA三螺旋生物傳感器 PNADNA-PNA三螺旋生物傳感器是以一條多聚嘧啶PNA鏈與一條多聚嘌呤DNA鏈通過Waston-Crick氫鍵生成雙鏈；另一條多聚嘧啶PNA鏈通過Hoogsteen鍵嵌入雙鏈大溝、形成三螺旋結構的生物傳感器，其特征是PNA鏈與DNA鏈按2∶1結合（圖2-A）［30］。2006年，加利福尼亞大學Michael Bowers教授［31］團隊率先發現了經過熒光基團標記的PNA與DNA序列特異性結合、形成的PNA-DNA-PNA三螺旋在加入特定的陽離子共軛聚電解質（Cationic conjugated polyelectrolyte，CCP）后，通過熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，TRET） 可以增強PNA2/DNA三螺旋的熒光，建立了一種基于PNA/DNA三螺旋的光學傳感器。2009年，新加坡國立大學Liu教授［32］團隊利用PNA/DNA/PNA三螺旋無法被S1核酸酶降解的特性，加入嵌入型的噻唑橙（Thiazole orange，TO）染料后顯微弱熒光，再加入特定的CCP后，通過TRET增強熒光發射；而相應的含有單堿基錯配的DNA/PNA三螺旋能夠被S1核酸酶降解、無法產生熒光。因此，所建立的基于PNA-DNA-PNA三螺旋的熒光傳感器可以實現無標記、高選擇性的單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism）的檢測（LOD=5 μmol/L）。

2.4.2 DNA-PNA-DNA三螺旋生物傳感器 DNAPNA-DNA三螺旋生物傳感器是單鏈PNA通過Hoogsteen鍵嵌入到雙鏈DNA大溝中形成三螺旋結構、輸出反應信號的生物傳感器（圖2-B）。2006年，Michael Bowers教授團隊研究發現：經過熒光基團標記的PNA與雙鏈DNA的序列特異性結合、形成的DNA-PNA-DNA三螺旋在加入特定CCP后，通過TRET可以增強DNA2/PNA三螺旋的熒光，建立了一種基于PNA/DNA三螺旋的光學傳感器［31］。2007年，德國Oliver Asitz教授團隊將分子信標進行結構改造，loop區域為靶標DNA鏈互補區域（實現靶標的特征識別），stem區域則利用富含A的PNA鏈與富含T的雙鏈DNA形成DNA2/PNA三螺旋。當檢測體系中加入靶標DNA鏈，三螺旋分子信標發生結構轉換、莖環結構被打開、開啟熒光信號、實現傳感。值得一提的是，該傳感器具有3個顯著特點：其一，識別靶標DNA的靈敏度與特異性能夠被DNA2/PNA組成的三螺旋stem所調節；其二，PNA鏈標記的熒光基團在形成三螺旋結構后，形成的超淬滅熒光發卡結構能夠顯著降低熒光背景，實現檢測的高信噪比；其三，借助高特異性與高信噪比的特性，該DNA-PNA-DNA三螺旋熒光傳感器可以實現單堿基區分［33］。2013年，伊朗 Mohammad Saeid Hejazi教授團隊將PNA鏈固定在金電極上，通過PNA鏈特異性捕獲特征雙鏈DNA形成三螺旋結構導致的電信號變化，實現了對靶標DNA雙鏈的檢測［34］。

圖2 三螺旋PNA/DNA生物傳感器的兩種類型

2.5 可視化TNAs生物傳感器

可視化TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識別元件對輸入信號進行識別響應，以光學響應信號為基礎，通過裸眼比較反應液中顏色的深淺的變化，實現對目標物的肉眼識別檢測的傳感方法。當金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）之間的距離改變時，其局域表面等離子共振吸收峰會產生相應的變化，引起溶液顏色的改變［35］。2006年，韓國Insung S. Choi教授團隊分別在AuNPs上共價偶聯兩條核酸鏈，通過調節溶液體系的pH值，使反應體系在酸性條件（pH5.0）下形成C-G*C、T-A*T三螺旋結構，從而拉近AuNPs之間的距離，使AuNPs粒子聚沉、發生從紅色到藍色的顏色變化［36］。2011年，中山大學凌連生教授團隊利用Ag+可以在弱堿性（pH8.0）條件下穩定C-G*C三螺旋結構的性質，使AuNPs粒子上的兩條鏈通過C-G*C Ag+三螺旋結構，距離有效拉近，發生顏色變化，從而實現Ag+的傳感檢測［37］。2015年，伊朗Khalil Abnous教授團隊設計了一種基于TNAs莖環結構的可視化傳感器，通過靶物質（四環素）與loop區域的親和結合、誘導TNAs莖環結構解組裝、釋放第三鏈，在高鹽條件（50 mmol/L NaCl）下，釋放的第三鏈能夠維持AuNPs的穩態，抵抗高鹽聚沉效應，使溶液呈現明亮的紅色；而陰性對照組因TNAs莖環結構的穩定存在，AuNPs在高鹽環境中發生聚沉呈現藍色，從而實現了四環素的可視化、超靈敏（檢測限，Limit of detection，LOD=266 pmol/L） 檢 測［27］。 通 過 與AuNPs結合，使TNAs生物傳感器具有可視化、簡便、快速等優點，但由于AuNPs的聚沉容易受鹽離子濃度、金屬陽離子濃度的干擾，因此基于AuNPs的可視化TNAs生物傳感器的穩定性有待于進一步研究。

2.6 熒光TNAs生物傳感器

熒光TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識別元件對輸入信號進行識別響應，以熒光響應信號的強度變化，實現對目標物的傳感響應的方法。最常使用的研究策略是根據熒光供體基團與熒光受體基團的距離變化誘導FRET，發生正向的熒光增強或負向的熒光減弱，從而表征對目標物的傳感響應。2001年，新澤西Thomas Antony［20］團隊建立了一種正向的熒光增強型的TNAs傳感方法：預先在分子信標的5′末端與3′末端標記熒光供體基團（Fluorescein）與熒光受體基團（DABCYL），在沒有待測雙鏈DNA出現時只有很低的背景信號；當體系中存在待測的雙鏈DNA時，分子信標解構發生結構變化、并與雙鏈DNA分子形成三螺旋DNA，使Fluorescein基團與DABCYL基團之間的距離增大、無法發生FRET而淬滅Fluorescein基團的熒光，因此發射出較強的熒光，從而通過熒光強度變化表征待測雙鏈DNA的濃度。2014年，山東大學姜瑋教授團隊利用熒光淬滅基團（Black hole quencher-1，BHQ-1標記的三核酸第三鏈與熒光基團（6-carboxyfluorescein，6-FAM）標記的雙鏈DNA，通過Ag+穩定三螺旋DNA的形成，同時6-FAM與BHQ-1發生FRET導致熒光淬滅。當存在轉錄因子（Transcription factors，TFs）時，目標物TFs與雙鏈結合釋放BHQ-1標記的第三鏈，使雙鏈DNA的6-FAM釋放熒光信號，實現對TFs的定量檢測［14］。

除此之外，利用芘分子在單體狀態與二聚體狀態的熒光發射波長與熒光發射強度不同，也可對TNAs生物傳感信號進行表征。2015年，湖南大學譚蔚泓教授團隊設計了一種莖環狀的DNA三螺旋分子開關，只有當目標物Tmb、ATP、L-Arm存在時，目標物與莖環結構的loop區域親和結合、莖環狀三螺旋結構解構，第三鏈自發形成發卡結構、使標記在5′端與3′端的芘分子在空間上聚集形成二聚體，在480 nm處的熒光強度顯著增強，實現Tmb、ATP、L-Arm的通用型檢測［25］。利用標記熒光基團建立的TNAs生物傳感器通常能夠實現目標物的靈敏檢測，但由于標記熒光基團的高昂成本與技術制約，熒光TNAs生物傳感方法的建立往往需要耗費更多的人力物力。

2.7 表面增強拉曼光譜（Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）-TNA生物傳感器

SERS-TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識別元件對輸入信號進行識別響應，以SERS響應信號的強度變化，實現對目標物的傳感響應的方法。目前，常常把SERS信號分子修飾在DNA鏈或納米材料上構建Raman增強基底，實現對目標待測物的傳感響應。2012年，譚蔚泓教授團隊利用目標物與loop區域的特異性親和、誘導的DNA三螺旋莖環的結構變化，實現了SERS信號分子（羅丹明6G，rhodamine 6G，R6G）標記的銀納米粒子（Silver nanoparticles，AgNPs）在金膜表面的距離發生改變，導致SERS信號的傳感響應［38］。2012年，Duncan Graham教授團隊將Raman信號分子羧基-X-羅丹明異硫氰酸鹽（Carboxy-X-rhodamine isothiocyanate，ROX-ITC）標記在AgNPs上，利用三核酸DNA的序列特異性結合，通過改變待測雙鏈DNA的長度，實現TNAs的長度變化、進而調節AgNPs粒子間的距離變化，通過AgNPs間的距離與SERS信號強度呈負相關，實現對不同長度的雙鏈DNA的測定［39］。2014年，湖南大學楊榮華教授團隊利用目標物與loop區域的特異性親和、誘導的DNA三螺旋莖環的結構變化、釋放第三鏈，第三鏈被鏈霉親和素包被的硅珠捕獲后、促發帶有活性巰基（-SH）末端修飾的鏈式雜交反應（Hybridization chain reaction，HCR），HCR自組裝體與Raman信號分子（4-氨基苯硫酚，4-aminobenzenethiol，4-ABT）修飾的AuNPs共價偶聯、實現SERS信號的傳感響應［40］。

2.8 電化學TNAs生物傳感器

電化學TNAs生物傳感器是以TNAs作為生物識別元件對輸入信號進行識別響應，以電化學響應信號的強度變化，實現對目標物的傳感響應的方法。由于電化學傳感平臺具有制作成本低廉、操作簡便、靶標范圍廣泛等優點，常常將標記有電化學信號分子的核酸鏈固定在電極表面，依據有無待測物導致的固定化核酸鏈上信號分子傳遞電子的效率差別，實現電化學信號（電流、電阻抗和點位等）的表征。1997年，前捷克共和國Emil Palecek教授團隊利用固定化的DNA單鏈利用三核酸DNA的序列特異性結合靶標雙鏈DNA形成三螺旋DNA，TNAs結構中G單元發生電化學氧化傳遞電子，實現了電化學DNA傳感［41］。但利用G氧化傳遞電子的缺陷是傳感體系容易受到外界環境干擾、不利于復雜樣品的檢測。2014年，羅馬大學Francesco Ricci教授團隊利用標記有氧化還原反應基團（甲基藍）的固定化單鏈DNA序列特異性探針捕獲目標DNA單鏈、形成夾鉗狀三螺旋DNA、促使甲基藍與金電極的靠近、導致傳遞電子的效率增強。利用待測DNA單鏈的濃度與有效電子傳遞的正相關關系，實現了單鏈DNA在復雜血清樣本中的單堿基錯配區分［28］。由于氧化還原基團標記的固定化探針會增加電化學傳感平臺的檢測成本，2015年，青島農業大學李峰教授團隊利用G-四鏈體（G-Quadruplex）功能核酸作為免標記的電化學信號分子，使固定化的DNA探針與具有目標DNA互補區域的分子信標鏈形成莖環狀DNA三螺旋、封閉探針鏈G-四鏈體的類辣根過氧化物酶活性。當體系中出現目標DNA，目標物與loop區域互補、誘導莖環狀DNA三螺旋發生結構轉換、暴露出固定化DNA探針鏈。在氯高鐵血紅素的誘導下，探針鏈形成有活性的G-四鏈體結構，發揮類辣根過氧化物酶活性傳遞電子，實現電化學信號的輸出與目標DNA鏈的檢測［42］。

2.9 pH響應的TNAs生物傳感器

由于酸性條件促進C質子化、促進平行式C-G*C三螺旋堿基對的穩定形成、從而促進TNAs的穩定形成；而中性條件促進平行式T-A*T三螺旋堿基對的穩定形成、從而促進TNAs的穩定形成［18］，因此由C-G*C、T-A*T組裝的三螺旋DNA結構具有pH效應。研究者們開發出了多種具有pH響應效應的TNAs生物傳感器。pH響應的TNAs生物傳感器的顯著特點是通過改變溶液的pH，可視實現傳感器可逆化的周期性響應。但由于反應體系的復雜性，其周期性響應的循環次數通常不夠理想，需要進一步加強研究。

2.9.1 pH響應的TNAs等溫擴增傳感器 pH響應的TNAs等溫擴增傳感器是以TNAs為pH響應元件、介導的恒溫擴增傳感器。2014年，中國科學院樊春海教授與羅馬大學Francesco Ricci教授合作研究了兩種pH響應模式的DNA鏈置換擴增（Strand displacement amplification，SDA）傳感器。一種是OH-激活的SDA：在OH-誘導下，以C-G*C為主要序列組成的三螺旋結構中的Hoogsteen鍵斷裂形成雙螺旋結構，加入侵入鏈（Invading strand，IS）發生SDA、產生游離的三螺旋第三鏈、發生后續的SDA。另一種是H+激活的SDA：帶有兩側黏性末端的雙鏈S首先與IS雜交結合，在H+誘導下，IS與abc鏈形成三螺旋DNA、釋放b*c*d*鏈、發生后續的SDA。利用標記在DNA鏈上的熒光供體基團與熒光受體基團表征pH響應的SDA傳感器的搭建［43］。2015年，蒙特利爾大學Alexis Vallee-Belisle教授與羅馬大學Francesco Ricci教授合作研究了兩種pH響應模式的雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction，HCR）傳感器。在OH-誘導下，儲存有HCR自組裝能量的發卡tH1的 5′末端的Hoogsteen鍵斷裂，暴露出黏性末端，發生后續的HCR；在H+誘導下，HCR激發子鏈與含有HCR自組裝能量的發卡tH1能夠形成I·tH1三螺旋結構、鏈剝離釋放cb*黏性末端、發生后續的HCR。利用標記在DNA鏈上的熒光供體基團與熒光受體基團表征pH響應的HCR傳感器的搭建［44］。

2.9.2 pH響應的TNAs納米開關 pH響應的TNAs納米開關是指以TNAs為pH響應元件、調控所構建的DNA納米組裝體發生結構變化，發揮開關（onff）型作用、能夠開啟或關閉表征信號的兩態傳感器。2004年，普渡大學Chengde Mao教授利用標記有羅丹明綠與BHQ-1的熒光探針F、長鏈DNA（L）與斷鏈DNA（S）進行雙鏈自組裝體與三鏈-鑷子狀自組裝體的結構轉換，通過改變溶液的pH（5.0-8.0）、可逆性地改變三螺旋DNA的形成與解構，通過FRET與聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）表征了所設計的納米開關的鑷子樣非三螺旋-on態與鑷子樣三螺旋-off態［45］。2015年，北京理工大學張小玲教授，廈門大學康懷志教授與湖南大學譚蔚泓教授合作研究了一種基于C-G*C堿基對的鑷子狀TNAs納米開關。該納米開關由三條鏈構成，在中性條件下，三條鏈雜交成長直雙鏈結構，因無法實現FRET，使納米開關呈現強熒光信號的on態；酸性條件誘導C質子化形成C-G*C堿基對，形成的TNAs不僅使納米開關的結構變成類鑷子樣形態，而且發生FRET使納米開關呈現發出微弱熒光信號的off態，實現了在pH 4.6-7.8范圍內對細胞內pH梯度的檢測［46］。

2014年，羅馬大學Francesco Ricci教授團隊通過改變構成三螺旋結構的單鏈DNA的序列構成，且在單鏈DNA兩側分別標記熒光供體基團（Alexa Fluor 680和AF680）與熒光淬滅基團（BHQ-1），通過調節溶液pH，使單分子三螺旋納米開關在低pH條件下形成鏈內三螺旋結構、淬滅熒光，納米開關處于off態；高pH條件下Hoogsteen鍵斷裂形成雙螺旋解構、AF680恢復熒光發射，納米開關處于on態。因此，所構建的單鏈DNA三螺旋納米開關實現了跨5.5個pH單位（pH5.5-11.0）的傳感檢測［18］。

2.9.3 酶促反應介導TNAs的pH傳感響應 酶促反應介導TNAs的pH傳感響應是指以通過酶促反應生成質子或消耗質子，調控TNAs結構的生成或結構、實現信號傳感響應的過程。2015年，羅馬大學Francesco Ricci教授團隊首先研究了酶促反應調控的單鏈DNA三螺旋納米開關的on-off狀態轉換。以谷胱甘肽轉移酶催化谷胱甘肽產生質子、調控on型TNAs納米開關轉換為三螺旋結構的off型；以脲酶催化尿素消耗質子、調控off型的具有三螺旋結構的TNAs納米開關轉換為雙螺旋結構的on型。然后，研究者建立了酶促反應介導的鏈替代傳感模型：利用脲酶催化尿素消耗質子，調控TNAs的Hoogsteen鍵斷裂、生成雙螺旋，再使用侵入鏈進行鏈替代反應、輸出熒光信號。最后，研究者建立了酶促反應介導的配體釋放/攜帶傳感模型：利用乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿釋放質子，使與配體鏈雜交形成雙螺旋DNA的單鏈DNA形成分子內三螺旋組裝體、釋放配體鏈；利用脲酶催化尿素消耗質子，破壞單鏈DNA形成的分子內三螺旋組裝體，與配體鏈雜交生成雙螺旋、攜帶配體鏈［47］。將酶促反應與TNAs的pH效應組合傳感，為拓展TNAs生物傳感器在體內的應用奠定了理論基礎。

2.9.4 pH響應的納米粒子的聚集/分散 pH響應的納米粒子的聚集/分散是指通過pH變化調控TNAs的形成與解構、調控納米粒子間的距離、使納米粒子發生聚集或分散的傳感現象。2006年，成均館大學Yang-Gyun Kim教授與Insung S. Choi教授合作，預先分別在兩種AuNPs表面標記兩種不同的核酸鏈，形成偶聯有分子內雙鏈DNA的AuNPs-A與偶聯單鏈DNA的AuNPs-B。在酸性條件（pH5.0）下，C質子化形成C-G*C堿基對、促使兩條DNA鏈形成分子間三螺旋結構、拉近AuNPs-A與AuNPs-B之間的距離，使AuNPs聚沉呈現藍色。在中性條件（pH6.5）下，C-G*C堿基對中的Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋結構解體，AuNPs-A與AuNPs-B之間的距離增大、使AuNPs分散呈現紅色，實現了pH調控的AuNPs間可逆的聚沉與分散，通過顏色變化表征AuNPs之間的聚集與分散［36］。2008年，普渡大學Chengde Mao教授預先在一種AuNPs表面標記具有鏡像序列的Oligo A鏈形成A型AuNPs，在另一種AuNPs表面標記與Oligo A鏈互補的Oligo B鏈形成B型AuNPs。在中性條件（pH8.0）下，A型AuNPs與B型AuNPs上標記的DNA鏈雜交使AuNPs之間具有一定的距離；在酸性條件（pH5.0）下，C質子化形成C-G*C堿基對穩定TNAs的結構，拉近A型AuNPs與B型AuNPs之間的距離，產生更強的電子耦合，通過AuNPs的最大吸收峰紅移表征AuNPs之間的聚集與分散［48］。

2.9.5 pH響應的DNA折紙單元的低聚/分散 DNA折紙（Origami）單元作為一種新型的DNA納米自組裝結構單元，可以使用TNAs發揮橋連作用，實現pH響應的低聚與分散。2015年，以色列希伯來大學Itamar Willner教授團隊以TNAs作為DNA折紙單元的橋梁，構建了DNA Origami的二聚體［49］。首先，研究者在DNA Origami單元T3與T4上分別標記（1）鏈與（2）鏈，通過（1）鏈與（2）鏈的鏈雜交、使T3與T4形成二聚體；當體系pH調至4.5，C質子化形成C-G*C堿基對、使（1）鏈形成分子內三螺旋結構，同時發揮橋連作用的分子間雙鏈雜交解構、使二聚體T3/T4分散；當體系pH再次調至7.0，C去質子化導致Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構，T3與T4重新形成二聚體，實現DNA Origami單元的可逆化的低聚與分散。然后，研究者在DNA Origami單元T5與T6上分別標記（3）鏈與（4）鏈，通過（3）鏈與（4）鏈的鏈雜交、形成三螺旋發揮橋連作用、使T3與T4形成二聚體；當體系pH調至9.5，T去質子化導致T-A*T堿基對的Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構，使二聚體T5/T6分散；當體系pH再次調至7.0，促進T-A*T堿基對與三螺旋結構的形成，T5與T6重新形成二聚體，實現DNA Origami單元的可逆化的低聚與分散。

2.9.6 pH響應的單鏈閉環DNA的低聚/分離 單鏈閉環DNA作為一種人工DNA納米結構單元，可以在TNAs的橋連作用下，實現pH響應的低聚與分散。2016年，希伯來大學Itamar Willner教授團隊以TNAs作為單鏈閉環DNA納米結構單元的橋梁，構建了單鏈閉環DNA的二聚體［50］。首先，分別合成單鏈DNA閉環R1與R2，使C1、F1與R1鏈雜交、穩定R1的環狀形態，同時使C2、F2與R2鏈雜交，穩定R2的環狀形態；當體系pH調至7.0，C去質子化無法形成三螺旋結構，橋連鏈L1與R1鏈間雜交形成雙螺旋、使R1與R2形成二聚體；當體系pH調至4.5，C質子化形成C-G*C堿基對、使橋連鏈L1與R2形成分子間三螺旋結構，發揮去橋連作用、使二聚體R1/R2分離；當體系pH再次調至7.0，C去質子化導致Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構，橋連鏈L1重新與R1鏈間雜交形成雙螺旋、使R1與R2重新形成二聚體，實現單鏈閉環DNA單元的可逆化的低聚與分離。然后，改變策略、使用橋連鏈L2與L3連接R1與R2：當體系pH調至7.0，促進T-A*T堿基對的形成，L2、R1與L3形成三螺旋結構，使R1與R2形成二聚體；當體系pH調至10.0，T去質子化導致形成T-A*T堿基對中的Hoogsteen鍵斷裂、三螺旋解構、使使二聚體R1/R2分離；當體系pH再次調至7.0，再次形成T-A*T堿基對、L2、R1與L3形成三螺旋結構、使R1與R2形成二聚體，實現單鏈閉環DNA單元的可逆化的低聚與分離。

2.9.7 pH響應的微膠囊 近年來，微膠囊作為一種有效的藥物載體，受到廣泛關注。2016年，希伯來大學Itamar Willner教授團隊利用碳酸鈣（CaCO3）微粒攜帶冷光量子點硒化鎘/硫化鋅（CdSe/ZnS），外部包被多聚烯丙胺鹽酸鹽（Poly- allylamine hydrochloride，PAH）后，五條DNA鏈自組裝、沉積在帶正電的PAH外層形成微膠囊；并利用pH響應的TNAs調控了兩種微膠囊的解組裝［8］。在酸性條件（pH5.0）條件下，富含CG核酸自組裝體的微膠囊核酸外層中的C質子化形成C-G*C堿基對、形成分子內三螺旋結構，使微膠囊外部的DNA自組裝體解組裝，導致微膠囊解組裝釋放CdSe/ZnS量子點，在620 nm處發射熒光。在堿性條件（pH9.0）下，富含AT核酸自組裝體的微膠囊核酸外層中的T去質子化導致T-A*T堿基對中的Hoogsteen鍵斷裂、分子間三螺旋解構，使微膠囊外部的DNA自組裝體解組裝，導致微膠囊解組裝釋放CdSe/ZnS量子點，在560 nm處發射熒光。

2.9.8 pH響應的DNA瓦片的自組裝/解組裝 DNA瓦片（DNA tile）作為一種典型的DNA自組裝體，常常被視作通過黏性末端雜交互補、形成DNA晶格與DNA管狀結構的基本元素［51-52］，在DNA納米技術中舉足輕重。2016年，羅馬大學Francesco Ricci將pH響應的TNAs-SDA回路模塊化，與DNA tile的自組裝反應模塊串聯，實現了DNA tiles的自組裝［53］：在堿性條件下，C去質子化導致C-G*C堿基對中的Hoogsteen鍵斷裂、分子間三螺旋解構激活SDA回路、生成去保護鏈（Deprotector）；D激活鈍化的DNA瓦片單元（Protected tile，PT）自組裝形成超分子DNA管狀結構，釋放熒光信號。2017年，加利福尼亞大學Elisa Franco教授與羅馬大學Francesco Ricci教授合作，通過pH變化調控單鏈DNA三螺旋傳感器與調控子（Regulator）的雜交、調控DNA Tiles的自組裝與解組裝［54］：堿性條件下，C去質子化導致C-G*C堿基對中的Hoogsteen鍵斷裂、單鏈DNA三螺旋傳感器結構，生成的單鏈與regulator雜交生成雙螺旋DNA，鈍化regulator、使regulator無法與活性DNA tile的黏性末端雜交，活性DNA tile單元通過黏性末端雜交互補，自組裝成為DNA超分子管狀結構。酸性條件下，C質子化形成C-G*C堿基對、形成單鏈DNA三螺旋傳感器、使regulator從regulator-構成DNA三螺旋傳感器的富CG的鏈形成的雜交雙鏈中脫落；被剝離后的regulator與活性DNA tile的黏性末端雜交、鈍化DNA tile活性單元，使DNA超分子管狀結構解組裝成單個DNA tiles單元。

2.10 TNAs介導的擴增傳感器

由于擴增反應體系加入，使TNAs生物傳感器往往具有較好的靈敏度；但由于反應體系的復雜性，增加了傳感方法建立的難度。2014年，青島科技大學唐波教授設計了一種以磁納米粒子-莖環狀三螺旋DNA為生物識別元件、利用指數擴增反應（Exponential amplification reaction，EXPAR）放大識別信號的多循環SERS傳感器，實現了溶菌酶的高靈敏、通用型、快速檢測［55］。首先，目標物溶菌酶通過與磁納米粒子-莖環狀三螺旋DNA的Loop區域親和、改變三螺旋結構，暴露出的3′端單鏈區域與標記有SERS生物條形碼的Capture DNA雜交，在聚合酶與切刻內切酶的共同作用下、發生EXPAR反應剝離Trigger DNA鏈，釋放的Trigger DNA再次形成磁納米粒子-莖環狀三螺旋結構進入cycle 1；然后，在cycle 2中，cycle 1的EXPAR過程中由切刻內切酶切割、聚合酶剝離的DNA 1能夠不斷打開磁納米粒子-莖環狀三螺旋結構，與標記有SERS生物條形碼的Capture DNA，不斷促進cycle 1中的EXPAR擴增效率；在cycle 3中，cycle 1與cycle 2反應過程釋放的trigger 1能夠不斷打開磁納米離子-莖環結構，暴露的3′端單鏈區域與標記有SERS生物條形碼的Capture DNA雜交，發生EXPAR反應，不斷生成的Trigger DNA進入cycle 1促進cycle 1中的EXPAR擴增效率。

2015年，中山大學凌連生教授團隊借助TNAs與HCR搭載了一種增強型的電化學雙鏈DNA檢測平臺［12］。研究者首先在金電極表面共價偶聯捕獲探針（Capture probe），當存在目標物雙鏈DNA（dsDNA target）時，加入檢測探針（Detection probe），則capture probe/ dsDNA target/detection probe形成帶有單鏈黏性末端的三螺旋DNA結構；然后，單鏈黏性末端促發HCR，加入AuNPs表征電化學信號，從而實現對dsDNA target的檢測。

同年，凌連生教授團隊建立了一種基于TNAs的PCR擴增傳感器［56］。利用Tmb的劈裂適配體探針probe A與probe B結合目標物Tmb、形成帶有單鏈區域的雙鏈DNA，在DNA 聚合酶的延伸作用下生成完整雙鏈；該雙鏈DNA作為聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）的模板，在上下游引物P1與P2與輔助下生成大量PCR擴增產物；加入分子信標（Molecular beacon，MB），分子信標的莖環結構被PCR的雙鏈擴增產物打開、形成DNA三螺旋結構，因熒光供體基團與熒光淬滅基團無法發生FRET、熒光信號顯著增加，進行對PCR擴增的表征，實現了對Tmb的靈敏檢測。

2.11 納米材料-TNAs生物傳感器

近年來，具有納米尺度的新型納米材料與功能核酸結合，因具有諸多優良性質，如顏色變化、配體攜帶/釋放與相態轉變，而受到廣泛關注。TNAs作為功能核酸的重要組成成分，與AuNPs粒子共價偶聯后、通過pH調節，可以構建基于TNAs與AuNPs的可視化傳感器；與DNA origami納米單元或DNA單鏈閉環納米單元共價偶聯、通過pH調節，可以實現基于TNAs的DNA納米單元的低聚與分散。

核酸水凝膠是利用核酸序列的可編輯性、核酸行為的可預知性、功能核酸的功能可控性，通過核酸自組裝形成的親水性三維核酸網狀聚合物。基于TNAs的水凝膠主要指通過TNAs對不同外界環境因素的響應（主要指pH變化），完成水凝膠的膠態-液態相態轉化、使包裹在水凝膠中的信號分子在液態時被釋放、在膠態時被封閉的“智能水凝膠”。2015年，以色列希伯來大學Itamar Willner教授團隊將構成TNAs的兩條鏈分別共價偶聯在丙烯酰胺單體上，構建了兩種模式的水凝膠膠-液態相態傳感轉換［57］。在酸性（pH5.0）-中性（pH7.4）不同的pH條件下，中性pH使兩條DNA鏈雙鏈雜交、丙烯酰胺單體鏈相互交聯、形成聚丙烯酰胺凝膠態；酸性pH使其中一條DNA鏈形成分子內TNAs，聚丙烯酰胺解體生成丙烯酰胺單體，由膠態相變為液態。在中性（pH7.0）-堿性（pH10.0）不同的pH條件下，中性pH使兩條DNA鏈雜交生成TNAs、丙烯酰胺單體鏈相互交聯、形成聚丙烯酰胺凝膠態；堿性pH使分子間TNAs解構、聚丙烯酰胺解體生成丙烯酰胺單體，由膠態相變為液態。如果水凝膠的初次形成在有固定形狀的模具中完成，借助丙烯酰胺單體上雙螺旋殘基的相互作用，可以為水凝膠從液態恢復至固態提供短暫記憶，制作成具有的形狀記憶的“智能水凝膠”［58-59］。

除去丙烯酰胺可以作為TNAs水凝膠的單體，TNAs與多聚酰胺（Polyamidoamine，PAMAM G5）、右旋糖酐結合，也可以制作TNAs水凝膠。2016年，哈佛-麻省理工健康科技聯合中心的Natalie Artzi教授團隊設計了一種基于三鏈RNA的雙色熒光TNAs單元，該TNAs結構能夠與多聚酰胺結合、形成穩定的三螺旋納米顆粒；該三螺旋納米顆粒與右旋糖酐結合形成TNAs水凝膠，在體內調控癌細胞內源miRNA的表達，從而發揮抗癌作用［10］。目前，基于三螺旋核酸的水凝膠研究仍處于初級的理論探索階段，其在傳感、細胞成像、藥物遞送等領域具有巨大的應用潛力。

3 三螺旋生物傳感器的應用

3.1 TNAs傳感器用于單分子成像

近些年，研究者將TNAs傳感器用于成像領域，并做出了初步探索。2015年，京都大學Masayuki Endo教授與Hiroshi Sugiyama教授合作，將TNAs納米傳感元件應用于單分子成像［60］。研究使用C-G*C與T-A*T兩種堿基對構建TNAs納米結構，將靶標DNA鏈（1st-strand）與第三條DNA鏈（3rd-strand）分別標記在DNA origami單元上，當體系中存在第二條DNA鏈（2nd-strand），通過Waston-Crick氫鍵與Hoogsteen鍵的共同作用形成TNAs結構，使用快速原子力顯微鏡（Atomic force microscope，AFM）成像技術，可以觀察到DNA origami單元的中心形成了X形的交叉節點，即TNAs結構，實現了將TNAs應用于單分子成像。

3.2 TNAs傳感器用于配體的攜帶和釋放

近些年，研究者將TNAs傳感器用于配體的攜帶與釋放，并做出了初步探索。2016年，羅馬大學Francesco Ricci教授團隊將TNAs結構與劈裂適配體結合，設計了一種通用型、模塊化的TNAs傳感方法，利用TNAs結構的形成調控目標小分子的攜帶與釋放［61］。首先，研究者通過TNAs的形成拉近了劈裂ATP適配體的空間距離，在加入目標物ATP之后可以有效形成目標物/適配體的超分子聚合物，起到攜帶小分子目標物的作用；在加入TNAs結構中第三鏈的互補鏈competitor之后，competitor與TNAs的第三鏈結合形成更穩定的雙鏈DNA，破壞TNAs結構，使目標物/適配體的超分子聚合物結合能力下降，從而釋放ATP，起到釋放小分子目標物的作用。同時，由通用型、模塊化的TNAs傳感模塊也可以用于調控單鏈DNA的攜帶與釋放。

2017年，希伯來大學Itamar Willner團隊將TNAs與金屬-有機骨架（Metal-Organic Frame works，MOFs）結合，設計了一種pH響應性的用于配體釋放的門控模型［9］。研究者首先將氨基修飾的單鏈DNA（2）共價修飾到有羧基修飾的MOFs表面；然后將R6G作為模式配體目標物裝載到MOFs內部，利用偶聯在MOFs表面的單鏈DNA（2）與單鏈DNA（3）形成的雜交雙鏈發揮鎖式功能、將R6G封鎖在MOFs內部（pH 7.4）；當體系pH調至5.5時，C質子化形成的C-G*C堿基對促使單鏈DNA（3）形成TNAs結構、打開雜交雙鏈，使裝載到MOFs內部的R6G分子釋放。綜上所述，TNAs生物傳感器具備攜帶與釋放配體的潛力，但目前的研究僅僅停留在模式分子的研究層面。

3.3 TNAs傳感器用于細胞調控

2016年，哈佛-麻省理工健康科技聯合中心的Natalie Artzi教授團隊研究了一種基于RNA序列的TNAs水凝膠傳感器［10］。該TNAs水凝膠傳感器利用特異的RNA序列識別癌細胞內micro RNA（miRNA），發揮抑制癌細胞miRNA-221與替換癌細胞miRNA-205的雙重功能，在體內調控癌細胞內源miRNA的表達，發揮了抗癌作用。

3.4 TNAs傳感器用于檢測

近年來，TNAs傳感器廣泛應用于各類目標物的檢測，大大推動了快速檢測領域的技術革新。基于核酸鏈的互補、三螺旋核酸的特異性結合與aptamer與目標物的特異親和，目前TNAs傳感器用于檢測的目標物類別主要包括：核酸類目標物、細胞類目標物、蛋白類目標物、金屬離子類目標、微生物類目標物和抗生素類目標物［27］等。

3.4.1 檢測核酸類目標物 將TNAs傳感器應用于核酸類目標物的檢測，使用最為廣泛。2013年，羅馬大學Francesco Ricci教授團隊建立了夾鉗狀TNAs熒光傳感器，基于Waston-Crick氫鍵與Hoogsteen鍵形成的TNAs結構，實現了單鏈DNA的高靈敏度、高特異性檢測，能夠區分單堿基錯配［11］。2013年，福州大學林振宇教授團隊建立了基于TNAs的電化學傳感器，利用標記有二茂鐵的固定化核酸探針捕獲雙鏈DNA形成TNAs結構、導致的電化學信號變化，定量檢測雙鏈DNA［62］。2017年，湖南大學楊榮華教授與張小華教授團隊建立了莖環狀TNAs電化學傳感器，基于固定在金電極上的DNA探針與標記有二茂鐵的DNA探針形成的TNAs結構，在加入單鏈DNA待測物后的TNAs結構轉變、導致的電信號變化，實現了對單鏈DNA待測物的檢測［63］。2017年，湖南大學鄭晶教授與楊榮華教授團隊合作，將帶有熒光基團（Cy5，ROX）標記的莖環狀TNAs傳感元件偶聯在AuNPs上，由于FRET作用AuNPs淬滅了熒光基團的熒光；借助胞吞作用將AuNPs/TNAs超分子復合物攝入細胞后，通過信使RNA（Messenger RNA，mRNA）破壞TNAs結構、釋放熒光標記的DNA探針、定量輸出熒光信號，實現了細胞內mRNA的定量［64］。

3.4.2 檢測細胞類目標物 TNAs傳感器可以用于細胞類目標物的檢測。2014年，山東農業大學張教授團隊將TNAs傳感器應用于癌細胞的檢測［13］。首先，研究者將適配體（Aptamer）鏈標記在Fe3O4/Au復合納米顆粒表面，在cDNA鏈與Aptamer鏈互補之后，借助氯化甲氧糵因的穩定作用、使cDNA與雙鏈質粒形成穩定的TNAs結構，導入細胞后，TNAs結構如蛋白合成系統、高表達綠色熒光蛋白，實現了對目標細胞的檢測。

3.4.3 檢測蛋白類目標物 TNAs傳感器可以用于蛋白類目標物的檢測。2016年，GuangfengWang教授團隊在姜瑋教授利用TNAs傳感器檢測TF的基礎上［14］，利用電化學平臺的固定化DNA探針捕獲被TF置換下來的單鏈核酸，進而促發HCR反應，實現了以TF為代表物的蛋白質類的檢測［65］。

3.4.4 檢測金屬離子類目標物 TNAs傳感器可以用于金屬離子類目標物的檢測。2007年，伊利諾伊大學Yi Lu教授團隊使用含有TNAs結構銅離子依賴型脫氧核酶（DNAzyme）熒光傳感器，實現了銅離子的特異性靈敏檢測［66］。2016年，濟南大學魏琴教授利用T-Hg2+-T形成的分子內雜交雙鏈使莖環狀TNAs結構解構、釋放出的固定化單鏈探針利用AuNPs輔助、輸出電化學信號，實現Hg2+的檢測［67］。

3.4.5 檢測微生物類目標物 TNAs傳感器可以用于微生物類目標物的檢測。2017年，中國農業大學羅云波教授團隊構建了一種基于莖環狀TNAs的可視化傳感器［16］。研究者利用大腸桿菌內毒素（脂多糖）與莖環狀TNAs傳感元件的Aptamer loop區域結合，破壞TNAs結構、釋放的單鏈DNA探針被固定化的捕獲DNA探針抓獲、促發HCR反應，利用生物素-親和素標記的辣根過氧化物酶顯色系統可視化輸出檢測信號，實現了大腸桿菌的可視化檢測。

4 總結與展望

對TNAs生物傳感器的研究仍處于初級探索階段。在理論層面，首先，通用型TNAs傳感元件的應用受制于目標物-aptamer與TNAs形成的熱動力學平衡，仍需要借助物理化學、數學建模等交叉學科進一步完善通用型TNAs的理論模型、實現通用型分析傳感；其次，可逆型TNAs納米開關的再生效率通常在數次可逆反應后明顯降低，如何提高其再生效率及其使用次數仍是亟待解決的問題；最后，目前應用的TNAs傳感器的三螺旋序列組成主要局限在T-A*T與C-G*C兩種堿基對，探索其他三螺旋堿基對的理論性質、突破TNAs設計的序列枷鎖，對TNAs生物傳感器的推廣應用十分必要。在應用層面，目前的TNAs生物傳感器主要應用于快速分析檢測領域，處于檢測方法的搭建階段，且有些檢測分析方法流程復雜、不易重復再現，距離快速、靈敏、特異的檢測目標仍有較大差距。因此，簡化TNAs傳感器檢測方法的設計、增加其檢測穩定性仍然任重道遠；TNAs生物傳感器雖然具備攜帶與釋放配體、細胞內成像的潛力，但其研究僅僅停留在模式目標物的研究層面，距離藥物遞送、生物成像的應用目標仍有較大差距；TNAs傳感器在胞內調控等應用仍處在模型研究階段，仍要需要繼續探索。對于學科發展而言，DNA納米科技的發展離不開材料學的支撐，目前AuNPs與水凝膠技術的發展已經大大豐富了TNAs生物傳感器的搭建，未來新型材料的發展勢必會帶動納米級TNAs生物傳感器的革新與進步。相信隨著科技的進步，TNAs的生物傳感器在未來一定會有更為廣闊的應用前景。