27nt-miRNA對人臍帶間充質干細胞定向內皮細胞分化和管腔形成的影響及其分子機制

陶曉靜，楊鵬，沈鳳，顏淵鴛，李丹，羅雪蘭，甘娜，覃裕旺，歐和生,

(1廣西醫科大學藥學院，南寧530021；2廣西中醫藥大學附屬廣西國際壯醫醫院)

微小RNA(miRNA)是一類含21～28個核苷酸的單鏈保守內源性非編碼RNA。miRNA在轉錄后水平通過與信使RNA(mRNA)結合降解mRNA或抑制其翻譯來調控靶基因的表達，從而參與組織細胞的正常生理功能，調控某些疾病如腫瘤、心血管疾病的病理生理過程[1]。血管內皮細胞 (vascular endothelial cells, VECs) 功能紊亂是多種心血管疾病發生發展的起始環節。研究[2]發現，miRNA參與內皮細胞的增殖、遷移、分化與凋亡等功能調節。人臍帶間充質干細胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, hUCMSCs)具有多向分化潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞及內皮細胞等[3]。血管生成是一個復雜的過程，其中涉及干細胞定向內皮分化。miRNA在干細胞定向內皮分化過程中起著至關重要的作用[4]。我們的前期研究[5]證實，27nt-miRNA與轉錄因子共同參與調控其宿主基因內皮型一氧化氮合酶( endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達，進而影響VECs的增殖、遷移和管腔形成能力。此外，間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)定向血管內皮細胞分化后eNOS的表達/活性增加，血管活性分子一氧化氮(nitric oxide，NO)合成與釋放增加[6]。因此，27nt-miRNA是否通過調控eNOS表達影響hUCMSCs定向內皮細胞分化過程及分化后細胞的成管能力，值得關注。2017年10月08日～2018年4月25日，我們通過構建27nt-miRNA高表達質粒，慢病毒包裝后轉染hUCMSCs，觀察其對hUCMSCs定向內皮細胞分化及對分化后細胞管腔形成能力的影響，并探討相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 hUCMSCs。血清替代品，培養基，血管內皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)，慢病毒GV367載體及AgeI / NheI酶，四甲基偶氮唑鹽(MTT)，總RNA提取試劑盒(TRIzol 法)，eNOS兔源單克隆抗體，羊抗兔IgG-HRP，NO含量測定試劑盒，人工基底膜(Matrigel)。倒置顯微鏡，酶聯免疫檢測儀Model-450，Alpha化學發光凝膠成像系統Fluor Chem HD2。

1.2 目的基因表達質粒構建及慢病毒包裝 委托上海吉凱基因化學技術有限公司根據來源于eNOS基因第4內含子中的27堿基重復序列即27nt-miRNA序列5′-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3′ 、27nt-miRNA反義序列及隨機對照序列5′-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3′分別設計27nt-miRNA過表達、27nt-miRNA抑制物(anti-27nt-miRNA)及對照基因片段。采用PCR技術獲取目的基因，通過基因重組技術(AgeI / NheI 酶切)將目的基因分別克隆到GV367慢病毒載體中，進行PCR鑒定及DNA測序比對分析，構建相應的27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及對照慢病毒載體。載體含有增強綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)及嘌呤霉素，轉染成功的hUCMSCs可用嘌呤霉素進行篩選，建立穩轉細胞株。

1.3 hUCMSCs轉染和誘導定向內皮細胞分化 將hUCMSCs用含2%血清替代品、2%谷氨酰胺和1%青霉素/鏈霉素的培養基培養傳代。選擇生長狀態良好的第3～5代hUCMSCs用于轉染。hUCMSCs消化、離心，棄上清后用完全培養基重懸，制備3×104/mL的細胞懸液，取2 mL細胞懸液接種于6孔板，過夜培養約24 h。鏡下觀察細胞狀態，穩定后分為27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組，分別轉染27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及對照慢病毒載體：首先根據預實驗確定的慢病毒轉染條件及感染復數(Multiplicity of infection, MOI)=70，配制增強液(ENi.S.)1 mL/孔，Polybrene 5 μg/mL，根據三種病毒的滴度及公式[病毒體積=(MOI×細胞數目)/病毒滴度]來配置三組轉染液。棄去原培養液，PBS清洗2次后，每孔分別依次加入1 mL轉染液，放回培養箱孵育8～12 h(過程中注意觀察細胞形態，發生變化可提前換液)，更換為2 mL完全培養基。繼續培養至轉染48 h后，更換含濃度為8 μg/mL嘌呤霉素的完全培養基篩選。轉染約72 h，換液棄去因未轉染被嘌呤霉素殺死的細胞，熒光顯微鏡觀察轉染效果(觀察細胞的綠色熒光效率及強度)。轉染成功后分別將三組細胞消化收集，以2×104/孔接種于6孔板中，三組細胞每孔均用2 mL含有1%血清替代品、1%谷氨酰胺、20 ng/mL的VEGF及10 ng/mL的b-FGF培養基誘導分化，隔天半量換液，誘導9 d。鏡下觀察分化期間細胞形態學變化并拍照。

1.4 各組細胞增殖能力觀測 采用MTT法。各組轉染并誘導分化后的細胞分別以每孔 5×103個接種到 96孔板，待細胞達到50%融合時更換無血清培養基培養24 h(實現細胞同步生長)，每孔加10 μL的 MTT繼續孵育4 h。棄去培養液，每孔加入 100 μL的二甲基亞砜，震蕩15 min。酶聯免疫檢測儀在570 nm的波長下測定光密度值(OD值)，以此代表細胞增殖能力。

1.5 各組細胞上清液NO檢測 采用硝酸還原酶法。 在誘導hUCMSCs分化過程中，分別吸取各組第1、3、5、7、9天的培養基上清，3 500 r/min離心10 min，-80 ℃凍存，檢測前37 ℃水浴快速融化，按試劑盒說明書步驟逐一進行，最后使用酶聯免疫檢測儀在550 nm波長測定各組的OD值。根據測得的OD值計算各組各時間點的NO濃度：NO濃度(μmol/L)=(測定管OD值-空白管OD值)/(標準管OD值-空白管OD值)×標準管濃度(100 μmol/L)×稀釋倍數。

1.6 各組細胞管腔形成能力觀測 采用Matrigel實驗。實驗前將Matrigel置于4 ℃解凍，在冰上按17～20 μL/孔將其均勻鋪于96孔板(注意不要有氣泡)，于37 ℃、5% CO2培養箱中放置1 h。各組細胞消化后，無血清培養基重懸，1×104/孔分別種于鋪好的Matrigel上，培養箱繼續培養12 h，鏡下觀察管腔形成情況。

1.7 各組細胞的eNOS mRNA檢測 采用RT-PCR技術。按TRIzol試劑盒逐步、分別提取每組細胞的總RNA。Primer 5.0軟件設計、合成人eNOS引物序列，上游引物序列為5′-AGGAACCTGTGTGACCCTCA-3′，下游引物序列為5′-CGAGGTGGTCCGGGTATCC-3′，GAPDH作內參。先將總RNA逆轉錄合成 cDNA，經擴增反應，取8 μL的 PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描、計算灰度值，以eNOS灰度值/GAPDH灰度值表示eNOS mRNA的相對表達量。

1.8 各組細胞的eNOS 蛋白檢測 ①免疫細胞化學法檢測各組細胞的eNOS 蛋白：將已轉染的各組hUCMSCs制成均勻的細胞懸液，以2×104/孔接種于預先放置在6孔板內的玻片上，用含1%血清替代品、1%谷氨酰胺、20 ng/mL 的VEGF及10 ng/mL的 b-FGF培養基誘導分化。待分化第9天，細胞長滿約80%后，PBS洗滌2次，2 mL的 4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min后取出玻片晾干。將1滴樹脂滴于載玻片上，將細胞玻片無細胞面緊貼樹脂固定，晾干待用。首先，用0.5% TritonX-100處理30 min，PBS洗滌2次；3% H2O2溶液處理10 min，PBS洗滌2次；5% BSA室溫封閉30 min，PBS洗滌2次。接著eNOS一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌2次后，加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌2次。最后DAB室溫顯色10 min，蘇木素復染，烘干后封片，鏡下觀察eNOS表達情況。②Western Blotting檢測各組細胞的eNOS 蛋白:用細胞裂解液RIPA裂解分化后的各組細胞，于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。各組分別取蛋白40 μg ，8% SDS-PAGE 上樣、電泳分離后，濕轉至PVDF膜。5% BSA室溫封閉1 h，加入eNOS一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜3次，各10 min。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫條件下孵育2 h后用TBST 緩沖液洗滌3次，各10 min。A、B化學發光檢測試劑按1∶1配制混合溶液，與膜反應 2 min。應用凝膠成像系統曝光、顯影、分析蛋白電泳條帶的灰度值。GAPDH為內參。eNOS蛋白的相對表達量=eNOS灰度值/GAPDH灰度值。

2 結果

2.1 27nt-miRNA慢病毒轉染效率及其對hUCMSCs分化形態的影響 各組27nt-miRNA慢病毒轉染效率均達到90%以上，見圖1A。三組hUCMSCs轉染后經同一條件誘導分化，結果見圖1B;對照組細胞亮度增強，觸角縮短，部分細胞呈多角形，出現內皮樣形態改變；27nt-miRNA組細胞分化不明顯，細胞體積較大，呈紡錘形，生長速度較慢，細胞數目較少，未形成管腔結構；anti-27nt-miRNA組少數細胞稍細長，呈短梭形，細胞間伸出偽足相連逐漸形成一個或半個管腔結構，管腔周圍細胞呈鋪路石樣排列。

圖1 27nt-miRNA慢病毒轉染結果及hUCMSCs分化形態

2.2 27nt-miRNA對hUCMSCs分化后細胞增殖的影響 細胞培養24 h后，27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組OD值分別為0.50±0.03、0.84±0.02、0.68±0.01；與對照組相比，27nt-miRNA組OD值降低26.47%，anti-27nt-miRNA組OD值增加23.53%；與27nt-miRNA組相比，anti-27nt-miRNA組OD值增加68%;組間兩兩相比，P均<0.01。

2.3 27nt-miRNA對hUCMSCs分化過程NO產量的影響 細胞分化第5天，27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細胞產生和釋放的NO含量分別為(121.25±3.71)、(191.37±2.95)、(182.99±9.12)μmol/L；與對照組相比，27nt-miRNA組細胞產生和釋放的NO量降低33.74%；與anti-27nt-miRNA組相比，27nt-miRNA組細胞產生和釋放的NO量降低36.64%；27nt-miRNA組與anti-27nt-miRNA組、對照組相比，P均<0.05。

細胞分化第9天，27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細胞產生和釋放的NO分別為(203.89±5.63)、(335.93±9.46)、(306.56±5.21)μmol/L；與對照組相比，27nt-miRNA組細胞產生和釋放的NO量降低33.49%；與anti-27nt-miRNA組相比，27nt-miRNA組細胞產生和釋放的NO量降低39.31%；27nt-miRNA組與anti-27nt-miRNA組、對照組相比，P均<0.05。

2.4 27nt-miRNA對hUCMSCs分化后細胞管腔形成能力的影響 與對照組相比，27nt-miRNA組細胞雖有聚集傾向，但未能形成完整的管腔樣網絡結構；anti-27nt-miRNA組細胞所形成的管腔數目較多，管腔網狀結構較小而緊密；見圖2。

圖2 各組hUCMSCs分化后細胞管腔形成情況

2.5 27nt-miRNA 對各組細胞eNOS mRNA表達的影響 27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細胞的eNOS mRNA相對表達量分別為0.48±0.01、0.76±0.02、0.63±0.02；與對照組相比，27nt-miRNA組eNOS mRNA相對表達量降低23.81%、anti-27nt-miRNA組增加20.63%；與27nt-miRNA組相比，anti-27nt-miRNA組的eNOS mRNA 相對表達量增加了58.33%；組間兩兩相比，P<0.05或P<0.01。

2.6 27nt-miRNA對各組細胞eNOS蛋白表達量的影響 27nt-miRNA組、anti-27nt-miRNA組、對照組細胞的蛋白相對表達量分別為0.43±0.03、 0.67±0.03、0.57±0.04；與對照組相比，27nt-miRNA組eNOS蛋白相對表達量降低24.56%、anti-27nt-miRNA組增加17.54%；與27nt-miRNA組相比，anti-27nt-miRNA組eNOS蛋白相對表達量增加55.81%；組間兩兩相比，P<0.05或P<0.01。

3 討論

miRNAs是MSCs外泌體中的重要組分，通過調控MSCs增殖、分化和歸巢，維持干細胞的基本特征[7]。研究[8]發現，MSCs成骨分化后提取的外泌體中多種miRNA如let-7a、miR-199b、miR-218等的表達顯著增加，而miR-221、miR-155、miR-885-5p等的表達顯著降低。此外，有研究[9]發現miRNA let-7f-5p通過抑制靶標Par6α促進MSCs向神經元樣細胞分化，miR-410通過下調Wnt3a促進MSCs成軟骨分化[10]。令人感興趣的是，miR-126通過激活PI3K / Akt和MAPK / ERK途徑促進MSCs向內皮細胞分化，且分化后特異性的內皮基因包括VEGF、eNOS，KDR和VE-粘附素表達顯著增加[11]。這與我們的前期研究即MSCs定向血管內皮細胞分化后eNOS的表達/活性增加的結果相符。eNOS基因第4內含子中的27 堿基重復序列是27nt- miRNA的來源，27nt-miRNA與轉錄因子共同參與調控其宿主基因eNOS的表達[12]。本研究發現，27nt-miRNA組hUCMSCs分化程度較低、eNOS mRNA及蛋白表達降低，而anti-27nt-miRNA組恰好相反，這一結果強烈提示27nt-miRNA在轉錄水平下調eNOS蛋白表達，從而抑制hUCMSCs定向內皮細胞分化。

在心肌缺血模型中移植過表達miR-126的MSCs后Dll-4的表達上調，可促進內皮分化、管腔及功能性微血管生成[13]。miR-210通過下調靶基因Efna3發揮其調節MSCs 向VECs分化作用及促血管生成效應[14]。eNOS組織特異性強，高表達于血管內皮細胞，其表達異常與心血管疾病的病理生理過程密切相關。Xia等[15]研究發現，eNOS/F92A-Cav1慢病毒載體轉染MSCs后eNOS蛋白表達及NO產量增加，上調的eNOS誘導激活VEGF通路，從而促進MSCs成脂、成骨分化和血管生成。本研究結果表明，27nt-miRNA對hUCMSCs 分化的內皮樣細胞的管腔形成有抑制作用。

正常情況下，為維持血管內環境的穩態，血管內皮細胞可分泌多種活性物質。其中，NO由eNOS以L-精氨酸為底物催化產生，是調節血管舒張的重要因子，在內皮細胞增殖、遷移和血管生成等方面起著重要作用[16]。血管生成是多階段的復雜過程，與內皮細胞功能密切相關。MSCs定向內皮細胞分化，可修復內皮損傷，調節內皮功能，促進血管生成，可能用于腫瘤、糖尿病并發癥及心血管相關疾病的治療。Chen等[17]證實eNOS和MSCs在調節心肌梗死后的心臟再生中有協同作用。該研究認為NO濃度的局部升高是激活血管生成的關鍵因素，此外eNOS也可能通過刺激促血管生成因子的分泌或增強內皮祖細胞的募集發揮作用。因此，27nt-miRNA極有可能是通過調控eNOS/NO通路對細胞增殖及管腔形成產生調控作用。

總之，本研究主要有以下三個方面的發現：27nt-miRNA抑制hUCMSCs分化、增殖，使其不能形成管腔結構；27nt-miRNA對hUCMSCs定向內皮細胞分化過程中eNOS mRNA及蛋白表達有明顯抑制作用；27nt-miRNA明顯抑制hUCMSCs定向內皮細胞分化過程中NO的產量。以上發現提示27nt-miRNA抑制hUCMSCs定向內皮細胞分化及管腔形成，而該影響與27nt-miRNA抑制eNOS蛋白表達有關。需要指出的是，MSCs定向內皮細胞分化及血管生成過程受多種因素調節，可能不僅僅受單一miRNA或基因所調控。27nt-miRNA是否與其他miRNA協同參與MSCs定向內皮細胞分化調節，27nt-miRNA對MSCs定向內皮細胞分化過程中eNOS表達的調控是否依賴其他因素如轉錄因子、VEGF，這些問題有待進一步探討。