200例無精癥患者染色體核型分析及Y染色體AZF基因微缺失情況觀察

師志云，陳源昊琪，于辛酉，馬一婧，王青，賈偉

(1寧夏醫科大學總醫院，銀川750001；2寧夏醫科大學；3寧夏臨床病原微生物重點實驗室)

在育齡期夫婦中，不育癥患者占15%，其中男方因素占50%[1]。在男性不育癥患者中，有50%是由精液異常引起的，其中無精子癥和嚴重少精子癥占0.7%[2]。Y染色體長臂上的無精子因子(azoospermia factor，AZF)對精子的生成起著重要的作用，因其攜帶了精子發生所需的重要遺傳信息[3]。Y染色體的AZF微缺失是繼Klinefelters綜合征后導致男性不育的第二大原因[4]。卵漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術已成功應用于臨床，使不育癥患者擁有自己的后代成為可能，但Y染色體AZF微缺失可能通過這種輔助生殖技術遺傳給后代[5]，所以無精、少精患者在ICSI治療前應篩查Y染色體AZF微缺失。本研究對200例無精癥患者進行了染色體核型分析及Y染色體AZF基因微缺失觀察。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1～12月在寧夏醫科大學總醫院就診的無精癥患者200例，年齡23～32歲。按照WHO《人類精液檢驗與處理實驗室手冊》進行精液分析確診為無精癥。200例患者均排除器質性病變(精索靜脈曲張、附睪疾病、生殖內分泌疾病及其他泌尿生殖系統等)、病毒感染，未患過腮腺炎、睪丸炎、附睪炎，未服用過對生殖系統可能造成損傷的藥物。患者對本研究知情同意。采集患者外周血5 mL，肝素鈉抗凝備用。

1.2 染色體核型分析 取患者外周血進行淋巴細胞培養后，按常規制備染色體(23對所有染色體)標本，G顯帶鏡檢至少20個中期分裂相細胞，分析3～5個核型。根據人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)對染色體進行染色體核型描述。

1.3 Y染色體AZF基因檢測 ①外周血DNA的提取：采用康為試劑公司的血液基因組柱式小量提取試劑盒提取人外周血基因組DNA，按照試劑盒說明書提取DNA，DeNovix核酸蛋白測定儀測定所提取到的DNA含量，-20 ℃保存。②Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區域6個序列標簽位點(STS)的多重PCR凝膠電泳檢測：受檢Y染色體AZFa區STS為SY84、SY86，AZFb區STS為SY127、SY134，AZFc區STS為SY254、SY255。同時設置兩個內對照基因(男性性別決定基因SRY和編碼鋅指蛋白基因ZFX/ZFY)進行擴增，并選用正常生育男性、正常女性和雙蒸水分別作陽性、陰性和空白對照。實驗方法嚴格按照試劑盒說明書進行。核酸電泳PCR產物10 μL，經2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)，觀察DNA電泳條帶。結果判讀：電泳后目的基因片段顯示擴增條帶，質控品均在控，該基因位點存在；電泳結果未見擴增基因顯帶，且重復2次仍無顯帶，質控品均在控，該基因位點缺失。③ Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區域6個序列標簽位點的熒光定量PCR檢測：選取上海透景生命科技有限公司AZF檢測試劑盒，Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區受檢STS同上，同時設置一對內對照SRY基因進行擴增，通過擴增曲線直接觀察結果。結果判讀：所有標本均應擴增出SRY對照條帶，若所測樣品中無此條帶，提示實驗失敗；出現一個或多個STS條帶丟失，質控品均在控，即可判斷為其對應的STS缺失。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果 200例無精癥患者中，發現9例染色體異常(占4.5%)，其中性染色體異常8例[包括4例Y等臂、2例47,XXY、1例inv(Y)、1例染色體多態Yqh+]、常染色體易位1例。

2.2 Y染色體AZF基因微缺失檢測結果 200例無精癥患者中Y染色體AZF基因微缺失的患者共有18例(總缺失率為9.0%)。其中AZFb+AZFc區缺失11例、AZFc區缺失5例、AZFb區缺失1例、AZFa區缺失1例，詳見表1。 多重PCR凝膠電泳和熒光定量PCR兩種方法檢測結果一致。

表1 18例Y染色體AZF基因微缺失情況

2.3 9例染色體異常者的Y染色體AZF基因微缺失情況 200例無精癥患者中的9例染色體異常者，伴有Y染色體AZF基因微缺失的有6例，詳見表2。

表2 9例染色體異常者的Y染色體AZF基因微缺失情況

3 討論

染色體異常是精子發生障礙的重要原因。本研究發現，200例無精癥患者中染色體異常者占4.5%(9/200)，與以往報道[6,7]的無精癥患者染色體異常率為2.2%～19.6%相近。染色體結構或數目異常會導致男性出現無精子、少精子或弱精子的臨床表現，是導致男性不育的重要因素之一。本研究從200例無精癥患者中檢出性染色體異常8例，包括4例Y等臂，1例克氏綜合征常見的染色體核型47,XXY(即出現兩條以上的X染色體)，表明性染色體異常對生精功能影響最大，這與文獻[8,9]報道相符；檢出常染色體異常1例(0.5%)，這個比例低于文獻[10]報道的1.1%～7.2%。性染色體異常的8例中染色體多態1例(0.5%)，也遠遠低于文獻[11]報道的12.2%～38%。后期我們需要增大樣本例數，提高研究結果的客觀性。

Y染色體微缺失和染色體異常是導致男子無精子癥和少精子癥的重要遺傳因素[12]。Y染色體AZF基因可劃分為AZFa、AZFb、AZFc3個不同區域，AZFa區缺失可導致唯支持細胞綜合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)，臨床表現為無精子癥[13]；AZFb和AZFb+AZFc整段缺失的患者典型睪丸組織學特征為SCOS或生精阻滯；AZFc缺失患者殘存了精子生成能力，多見于無精子癥或者嚴重少精子癥患者[14]。國內外不同實驗室報道的AZF基因總微缺失率跨度很大，為1%～55%[15]。本研究對200例無精癥患者進行AZF基因微缺失檢查，總體缺失率為9.0%，位于上述范圍但相對偏低，可能由于各實驗室選擇對象來自的地域不同有關，不排除其缺失率存在地域差異的可能。本研究發現，無精癥患者Y染色體AZF基因的AZFb+AZFc區域缺失最常見，其次為AZFc區域缺失，AZFa區域和AZFb區域缺失最少見，與文獻[16]報道的亞洲西南地區無精癥患者Y染色體微缺失率10%、缺失位點多數在AZFc區大致相同。

多重PCR凝膠電泳技術是我國Y染色體微缺失分子診斷指南(草案)推薦使用的方法，此方法可檢測STS較多，價格較實時熒光定量PCR技術便宜，但此方法有較多局限性，比如操作自動化不高，在檢測大批量樣本時十分耗時耗力，而且在電泳時需加入溴化乙錠，操作時容易污染實驗室。而熒光定量PCR檢測操作簡單，通過擴增曲線直接觀察結果，無需PCR后進行凝膠電泳，該方法比多重PCR凝膠電泳技術節約大量時間，減少工作量，提高臨床檢驗工作效率。本研究結果顯示，多重PCR凝膠電泳技術和熒光定量PCR技術對200例無精癥患者AZF基因的6個位點的檢測結果完全一致。

綜上所述，無精癥患者染色體核型異常及Y染色體AZF基因微缺失多見，可能是男性不育的重要原因。對于男性不育患者，檢測Y染色體AZF基因的微缺失是必要的，可明確無精子、少精子癥的發病原因，為患者接受輔助生殖治療和遺傳咨詢提供幫助。本研究分別采用多重PCR電泳技術與熒光定量PCR技術對無精癥患者的Y染色體AZF基因進行檢測，結果一致，熒光定量PCR技術更省時省力，因此適用于Y染色體AZF基因微缺失的篩查。