支氣管哮喘急性發作期患兒外周血去整合素金屬蛋白酶8、干擾素調控因子1水平觀察

李文開，鐘禮立，李云，黃寒，梁沫，易紅玲

(湖南省人民醫院/湖南師范大學附屬第一醫院，長沙410005)

支氣管哮喘是以氣道慢性炎癥為主要特征的呼吸系統疾病，由多種細胞如中性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞等炎癥細胞及其合成和分泌的炎癥細胞因子相互作用所致，好發于兒童[1]。流行病學調查[2]顯示，兒童支氣管哮喘發病率為2%～7%。兒童支氣管哮喘急性發作可導致支氣管炎性細胞浸潤、黏膜充血、分泌物增多等，阻塞患兒氣道，使呼吸阻力增加以及支氣管痙攣，加重患兒喘憋性呼吸困難及缺氧狀態[3]。早期診斷支氣管哮喘并及時評估病情嚴重程度，對制定針對性治療方案、改善患兒預后有重要意義。有研究[4]認為，炎癥反應、免疫功能異常等與支氣管哮喘發病密切相關。去整合素金屬蛋白酶(disintegrins metalloproteinase，ADAM)8屬于解聚素和金屬蛋白酶家族成員，ADAM8與氣道炎癥反應密切相關[5]。干擾素調控因子(interferon regulatory factor，IRF)1是核轉錄因子，主要介導了細胞免疫過程[6]。關于ADAM8、IRF1在小兒支氣管哮喘發病過程中的作用，目前相關研究相對較少。本研究觀察了支氣管哮喘急性發作期患兒外周血ADAM8、IRF1水平變化。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年6月～2018年3月湖南省人民醫院收治的支氣管哮喘急性發作期患兒91例(急性發作組)。納入標準：滿足2016年中華醫學會兒科學分會呼吸學組修訂的兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[7]中的第1～4條，或者滿足第4、5條。排除標準：①心臟功能不全者；②肝、腎功能障礙者；③納入研究前的1個月內接受過糖皮質激素或者免疫抑制劑治療者；④有藥物治過敏史者；⑤惡性腫瘤患者。按照“全球哮喘防治倡議”[8]標準將急性發作組患兒分為輕度組27例(男15例、女12例，年齡3～14歲)、中度組35例(男21例、女14例，年齡4～13歲)、重度組29例(男17例、女12例，年齡3～13歲)。同期隨機選取60例支氣管哮喘緩解期患兒為緩解組(男34例、女26例，年齡4～14歲)，60例健康體檢兒童為對照組(男38例、女22例，年齡3～14歲)。各組性別、年齡有可比性(P均>0.05)。本研究獲醫院倫理委員會批準，研究對象及家屬知情同意。

1.2 外周血ADAM8、IRF1 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。收集研究對象清晨空腹肘靜脈血4 mL于EDTA抗凝管中，根據Ficoll-hypaque密度梯度離心法將外周血中單個核細胞分離，置于TRIzol(瑞士Roche公司提供)中，-80 ℃保存備檢。用TRIzol提取外周血單個核細胞中的總RNA，利用反轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。ADAM8上游引物序列為5′-GGGAGAAACAACGAAGTTG-3′，下游引物序列為5′-GGTGTGATCAAGCACAGAT-3′，長度為256 bp；IRF1上游引物序列為5′-GCGGCACCTGGCGCACGGCT-5′，下游引物序列為5′-GGTGGAAGCACCAAGAC-3′，長度為128 bp；內參照β-actin上游引物序列為5′-GTGACGTGGACAATCCGCAAG-3′，下游的引物序列為5′-GGAAGGTGGACAACGGACGC-3′，長度為25 bp。采用熒光定量PCR法檢測ADAM8、IRF1 mRNA。擴增反應條件：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃持續20 s，共計40個循環，每個樣品重復上述操作3次。ADAM8 mRNA及IRF1 mRNA表達水平采用2-ΔΔCt表示。

1.3 ADAM8、IRF1蛋白檢測 采用BCA試劑盒測定外周血單個核細胞中總蛋白，Western blotting法檢測ADAM8、IRF1蛋白，嚴格按照試劑盒說明進行相關操作。

1.4 肺功能測定 采用耶格肺功能檢測儀檢測各組患兒肺功能指標，包括第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、用力呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

2 結果

2.1 各組外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平比較 急性發作組中的輕度組、中度組、重度組患兒外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平高于緩解組和對照組，并且輕度組、中度組、重度組患兒外周血ADAM8 mRNA、IRF1 mRNA及蛋白水平逐漸升高，見表1、2。

2.2 各組肺功能指標比較 急性發作組中的輕度組、中度組、重度組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于緩解組和對照組，并且輕度組、中度組、重度組患兒外周血FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF逐漸降低，見表3。

表1 各組外周血ADAM8、IRF1 mRNA表達水平比較

注：與緩解組、對照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

表2 各組外周血ADAM8、IRF1蛋白相對表達量比較

注：與緩解組、對照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

表3 各組肺功能指標比較

注：與緩解組、對照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

2.3 急性發作組患兒外周血ADAM8 mRNA、IFR1 mRNA水平的相關性及其與肺功能指標的相關性 急性發作組患兒外周血ADAM8 mRNA與IFR1 mRNA水平呈正相關(r=0.793，P<0.05)，ADAM8 mRNA水平與FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈負相關(r分別為-0.659、-0.702，-0.683、-0.761，P<0.05)，IFR1 mRNA與FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平呈負相關(r分別為-0.712、-0.735，-0.728、-0.756，P均<0.05)。

3 討論

目前，臨床主要根據患兒臨床表現、肺功能檢查等診斷支氣管哮喘，但不能全面有效評估病情而為臨床用藥提供指導。同時，年齡小于6歲的患兒肺功能檢查的依從性低，以致結果不穩定，準確性相對較低。尋找簡便、高效、重復性好的指標輔助臨床診斷支氣管哮喘，對指導臨床制定針對性治療方案具有重要意義。

研究[9]表明，氣道炎癥與支氣管哮喘發病密切相關，多種免疫細胞和炎癥因子介導了其發生、發展過程。ADAM是主要在免疫細胞如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞中表達的分泌型糖蛋白，其主要功能是調控炎癥細胞遷移以及參與惡性腫瘤的發病過程[10]。ADAM8屬于ADAM家族成員，具有824個氨基酸殘基膜蛋白，主要表達于細胞的胞質及胞膜中。研究[11]顯示ADAM8過度表達參與了肺癌等惡性腫瘤的發生、發展。Knolle等[12]對炎癥小鼠模型的研究發現，ADAM8能誘導炎癥細胞凋亡，清除肺部炎癥細胞，并進一步推斷ADAM8具有抗炎作用。Oreo等[13]發現嚴重哮喘患者痰液中ADAM8表達上調，并且與氣道中炎癥細胞的聚集密切相關，提示ADAM8可使哮喘患者炎癥細胞遷移至氣道。IRF是主要在細胞核中表達的轉錄因子，在干擾素信號通路的作用下調控多種基因的表達，進而參與細胞增殖、分化、細胞免疫等[14]。李茉莉等[15]研究IRF1在大鼠感染呼吸道合胞病毒中的作用，證實了IRF1通過介導大鼠神經源性炎癥介質表達而參與氣道炎癥的發生過程。梁雯慧等[16]發現IRF1表達異常參與調節炎癥反應，進而引起哮喘發生。

本研究結果顯示，支氣管哮喘急性發作期患兒外周血中ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平高于緩解組和對照組，并且急性發作期患者哮喘病情越嚴重，ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平也高。進一步比較ADAM8、IRF1蛋白在各組中的表達水平，也得到相似結果。上述結果說明ADAM8、IRF1高表達可能通過介導氣道炎癥反應而誘導支氣管哮喘的發作，并促進病情的進展。支氣管哮喘急性發作期患兒外周血ADAM8 mRNA與IRF1 mRNA水平呈正相關，提示兩種標志物通過協同作用引起氣道炎癥反應，共同介導支氣管哮喘的發病進程。

支氣管哮喘急性發作對患兒肺功能造成不同程度的損傷，病情越嚴重則肺功能損傷越嚴重。本研究發現，支氣管哮喘急性發作期患兒肺功能指標FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于緩解組和對照組，并且病情越嚴重的患兒其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平越低，提示上述指標能有效評估支氣管哮喘患兒病情嚴重程度。支氣管哮喘急性發作患兒外周血ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平與其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈不同程度負相關，說明ADAM8、IRF1異常表達水平越高，患兒炎癥反應越明顯，支氣管哮喘病情進展越快，病情越重，肺功能損傷加重，提示外周血ADAM8、IRF1可作為評估支氣管哮喘病情嚴重程度的重要標志物。

綜上所述，ADAM8、IRF1異常表達介導了小兒支氣管哮喘急性發作的發生、發展過程，并且與肺功能損傷程度有關，可作為臨床輔助評估小兒支氣管哮喘急性發作嚴重程度的指標，也可指導臨床用藥。