miR-204在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)及對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲功能影響觀察

王莉，陳小菊，鄭林媚

(海南省人民醫(yī)院，海口570000)

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期特有疾病，以孕婦妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床特征，常并發(fā)腎、心、肝等重要臟器的損傷，是孕產(chǎn)婦和圍生期胎兒死亡的主要原因之一[1]。胎盤淺著床和子宮螺旋動(dòng)脈重塑障礙導(dǎo)致胎盤功能下降和胎盤低灌注，是PE的基本病理特征[2]。迄今為止PE的發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究[3]發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、增殖功能的下降與胎盤淺著床和子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙密切相關(guān)，因此許多學(xué)者認(rèn)為PE是一種滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。目前研究[4]發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)的表達(dá)異常與PE的發(fā)生具有明顯的相關(guān)性，其可以通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)功能而導(dǎo)致PE的發(fā)生。Choi等[5]在研究中通過(guò)miRNA基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-204在PE患者胎盤組織中的表達(dá)異常增高，提示miR-204可能參與了PE的發(fā)生發(fā)展，但作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)不同程度PE患者胎盤組織中的miR-204進(jìn)行了檢測(cè)，同期采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-204模擬物至人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo，上調(diào)HTR-8/SVneo細(xì)胞中miR-204的表達(dá)，觀察上調(diào)miR-204表達(dá)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲功能的影響，并探討其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1月～2017年1月在海南省人民醫(yī)院住院接受剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的PE患者60例，其中輕度PE患者30例、重度PE患者30例；PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照“妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)”[6]，患有心臟病、糖尿病、原發(fā)性高血壓、腎病、甲狀腺功能亢進(jìn)等合并癥的孕產(chǎn)婦不納入本次研究。選擇30例同期接受剖宮產(chǎn)術(shù)分娩的正常孕婦作對(duì)照。所有研究對(duì)象剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤娩出后5 min內(nèi)，避開鈣化或出血點(diǎn)，在胎盤母體面中央?yún)^(qū)近臍帶根部剪取約1 cm×1 cm×1 cm的胎盤組織2塊，處理干凈血液后，置液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩E患者與正常孕婦的年齡、分娩孕周、BMI等基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象知情同意。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 人正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，在RPMI1640培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清)中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。TRIzol試劑和LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-204模擬物(miR-204 mimics)及陰性對(duì)照NC-mimics購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；miR-204、U6和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、GAPDH引物由上海吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)合成；一抗MMP-9、GAPDH以及HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning Costar公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 胎盤組織中miR-204的檢測(cè)及其靶基因預(yù)測(cè) 采用qRT-PCR檢測(cè)miR-204。TRIzol試劑提取胎盤組織總RNA，樣本OD260/OD280控制在1.8～2.0。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，miR-204以U6作為內(nèi)參基因。引物序列：miR-204 正向引物為5′-GCGGCGCAAAGAATTCTCCT-3′、反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6 正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min， 94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。miR-204相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。采用生物學(xué)信息法，查閱miRanda(http://www.microrna.org)并參閱相關(guān)文獻(xiàn)[7,8],預(yù)測(cè)miR-204可能作用靶基因。

1.4 HTR-8/SVneo細(xì)胞的miR-204 mimics轉(zhuǎn)染、miR-204和MMP-9 檢測(cè)、增殖和侵襲能力觀察 ①HTR-8/SVneo細(xì)胞的miR-204模擬物轉(zhuǎn)染及miR-204檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HTR8/SVneo細(xì)胞，按1.5×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5% CO2、飽和濕度恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)70%～80% 時(shí)將其分為miR-204 mimics組和NC-mimics組，轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞6 h，按LipofectamineTM2000說(shuō)明書操作分別將miR-204 mimics和NC-mimics轉(zhuǎn)染至兩組HTR8/SVneo細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h，采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-204(方法同上)。② HTR8/SVneo細(xì)胞增殖能力觀察：采用CCK-8。收集轉(zhuǎn)染后的兩組HTR8/SVneo細(xì)胞，按5 000/孔的密度加入96孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，即轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h，參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書于各時(shí)間點(diǎn)每孔分別加入10 μL 的CCK-8試劑，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度(OD)值(OD值越高表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng))。③HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲能力觀察：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。用基質(zhì)膠對(duì)Transwell的微孔膜進(jìn)行鋪膠，37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜固化后，兩組各取5×104個(gè)轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，將重懸的單細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室，小室的下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，棉簽輕輕擦棄小室上室的細(xì)胞，將已經(jīng)穿膜并黏附于微孔膜外表面的細(xì)胞以4%多聚甲醛固定5 min，染色，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中的細(xì)胞(穿膜細(xì)胞)數(shù)目。④ HTR8/SVneo細(xì)胞中MMP-9 mRNA和蛋白的檢測(cè)：采用qRT-PCR檢測(cè)兩組轉(zhuǎn)染后24 h細(xì)胞中的MMP-9 mRNA，與miR-204的檢測(cè)步驟相同，以GAPDH為內(nèi)參基因。MMP-9 正向引物為 5′- GAACCAATCTCACCGACAGG -3′、反向引物為5′- GCCACCCGAGTGTAACCATA-3′；GAPDH 正向引物為5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′、反向引物為5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。采用Western blotting檢測(cè)兩組轉(zhuǎn)染后24 h細(xì)胞中的MMP-9蛋白：常規(guī)提取兩組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣本取200 μL，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離;將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF膜，5 %脫脂奶粉4 ℃封閉4 h，緩沖液洗滌3遍;加入一抗MMP-9和GAPDH,室溫孵育2 h，緩沖液洗滌3遍;加入二抗，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3遍;增強(qiáng)發(fā)光法顯影，Quality One 軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 PE患者和正常孕婦胎盤組織中miR-204的表達(dá)比較及miR-204靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 PE患者和正常孕婦胎盤組織中miR-204的相對(duì)表達(dá)量分別為2.40±0.16、1.02±0.05，兩者相比，P<0.01；重度PE和輕度PE患者胎盤組織中miR-204的相對(duì)表達(dá)量分別為2.84±0.19、1.96±0.13，兩者相比，P<0.01。miRanda預(yù)測(cè)的miR-204作用靶基因可能是MMP-9,miR-204與MMP-9的3′UTR區(qū)存在種子序列互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。

注：mirSVR score表示熱力學(xué)穩(wěn)定性大小(要求≦-0.1)，分值越低表明miRNA與mRNA二者結(jié)合穩(wěn)定性越強(qiáng)，相應(yīng)miRNA下調(diào)基因的可能性越大； PhastCons score：表示基因非翻譯區(qū)在各物種中進(jìn)化保守性的強(qiáng)弱(≧0)，其值越大保守性越好。

圖1miRanda預(yù)測(cè)miR-204靶基因?yàn)镸MP-9

2.2 轉(zhuǎn)染后兩組HTR8/SVneo細(xì)胞的miR-204表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染后 miR-204 mimics組和NC-mimics組HTR8/SVneo細(xì)胞中miR-204的相對(duì)表達(dá)量分別為14.53±1.06、1.01±0.07，兩組相比，P<0.01，提示轉(zhuǎn)染miR-204 mimics能明顯上調(diào)HTR8/SVneo細(xì)胞miR-204的表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染后兩組HTR8/SVneo細(xì)胞增殖能力比較 轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)兩組HTR8/SVneo細(xì)胞OD值比較見表1，提示上調(diào)miR-204表達(dá)能明顯下調(diào)HTR8/SVneo細(xì)胞的增殖能力。

表1 轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)兩組HTR8/SVneo細(xì)胞OD值比較

注：與NC-mimics組相比，＊P<0.01。

2.4 轉(zhuǎn)染后兩組HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲能力比較 miR-204 mimics組和NC-mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(70±13)、(130±20)個(gè)，兩組相比，P<0.01，提示上調(diào)miR-204表達(dá)能明顯下調(diào)HTR8/SVneo細(xì)胞的侵襲能力，見圖2。

圖2 NC-mimics組與miR-204 mimics組穿膜細(xì)胞

2.5 轉(zhuǎn)染后兩組HTR8/SVneo細(xì)胞的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)比較 miR-204 mimics組和NC-mimics組HTR8/SVneo細(xì)胞的MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.45±0.10、1.00±0.06，兩組相比，P<0.01。miR-204 mimics組和NC-mimics組HTR8/SVneo細(xì)胞的MMP-9蛋白灰度值分別為0.14±0.06、0.45±0.10，兩組相比，P<0.01，電泳條帶見圖3。上述結(jié)果提示上調(diào)miR-204表達(dá)能明顯下調(diào)HTR8/SVneo細(xì)胞MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)。

圖3 miR-204 mimics組和NC-mimics組HTR8/SVneo細(xì)胞的MMP-9 蛋白的電泳條帶

3 討論

在正常妊娠過(guò)程中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮蛻膜和子宮螺旋動(dòng)脈，代替血管內(nèi)皮細(xì)胞，將狹窄的彈性血管變?yōu)榈妥琛o(wú)彈性且擴(kuò)張的子宮胎盤血管，并失去對(duì)血管活性物質(zhì)的敏感性，完成子宮螺旋動(dòng)脈的重塑，從而使流入絨毛間隙的血量明顯增加，維持胎盤正常的功能[9]。滋養(yǎng)細(xì)胞正常的侵襲和增殖能力是子宮螺旋動(dòng)脈成功重塑的關(guān)鍵。滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲能力的下降，均能影響子宮螺旋動(dòng)脈的重塑，造成胎盤淺著床，是PE的重要發(fā)病機(jī)制[10]。

近年來(lái)研究[5，11]表明，PE患者胎盤組織及外周血中存在著大量異常表達(dá)的miRNA，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)功能，與子癇前期的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)[12]。Xiao等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-144在PE患者胎盤組織中表達(dá)降低，造成滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低,可能與PE的發(fā)病有關(guān)。Xie等[14]報(bào)道m(xù)iR-519d通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力而參與PE的發(fā)生發(fā)展。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤組織中miR-20a表達(dá)升高，抑制FOXA1的表達(dá)，進(jìn)而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與侵襲能力。miR-204是miRNA家族重要成員之一，定位于人類第9號(hào)染色體,在許多惡性腫瘤中表達(dá)異常,在調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等過(guò)程中起著重要的作用[16]。近期miRNA基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-204在PE胎盤組織中高表達(dá)[5]，在PE患者的血漿中也發(fā)現(xiàn)miR-204表達(dá)明顯升高[17],提示miR-204可能參與了PE的發(fā)生發(fā)展，但具體作用機(jī)制尚不明確。在本研究中，我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PE患者胎盤組織中miR-204的表達(dá)顯著高于正常孕婦，且重度PE患者胎盤組織中miR-204的表達(dá)顯著高于輕度PE患者，提示PE患者胎盤組織中miR-204異常高表達(dá)與PE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

研究[18]發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲特性和逃避免疫系統(tǒng)的能力與癌細(xì)胞極其相似，而miR-204在調(diào)控癌細(xì)胞增殖及侵襲方面的作用已被廣泛證實(shí)[19～21]。為了研究miR-204是否也能通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲等細(xì)胞功能參與PE的發(fā)生發(fā)展，我們通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中miR-204的表達(dá)，模擬PE患者滋養(yǎng)細(xì)胞中miR-204的高表達(dá)狀態(tài)，分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖和侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-204的滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯下降。這一結(jié)果更好地闡明了高表達(dá)miR-204導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲等細(xì)胞功能不足，最終導(dǎo)致了PE的發(fā)生。

miR-204調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的下游分子通路尚不明確。我們應(yīng)用生物學(xué)信息法并結(jié)合基因的功能分析，預(yù)測(cè)miR-204的可能作用靶基因是MMP-9,因?yàn)閙iR-204與MMP-9的3′UTR區(qū)存在種子序列互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。miR-204在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[22]和惡性黑色素瘤[8]中可以通過(guò)靶向調(diào)控MMP-9進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)行為。為了驗(yàn)證miR-204是否也通過(guò)調(diào)控MMP-9影響滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲等細(xì)胞功能，我們通過(guò)qRT-PCR 和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-204的滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯下降，提示miR-204在PE發(fā)生發(fā)展中的作用與其對(duì)MMP-9基因的靶向調(diào)控有關(guān)。MMP是一類含有鋅原子結(jié)合位點(diǎn)的蛋白水解酶家族,能夠?qū)?xì)胞外基質(zhì)中多種成分進(jìn)行降解。MMP-9是MMP家族分子量最大的明膠酶，能夠水解彈力纖維和V型膠原，分解細(xì)胞基質(zhì)膜，在滋養(yǎng)細(xì)胞植入中發(fā)揮著重要作用[23]。有研究[23～25]已經(jīng)證實(shí)胎盤組織中MMP-9水平的下降與PE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。敲除MMP-9基因的大鼠會(huì)出現(xiàn)胎盤植入困難，進(jìn)而出現(xiàn)PE的表現(xiàn)[26]。抑制MMP-9活性可以明顯降低滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖及侵襲等細(xì)胞學(xué)功能[27,28]。

綜上所述， miR-204在PE胎盤組織中表達(dá)明顯增加。高表達(dá)miR-204能夠通過(guò)調(diào)控MMP-9的表達(dá)使滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲能力下降，與PE的發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果為探明PE的發(fā)病機(jī)制和尋找有效治療方法提供了新的思路。