上皮性卵巢癌組織中WWOX蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Elf5和Snail1、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志分子的表達(dá)觀察

胡亞坤，胡冠宇， 閆洪超，劉永利，李欣

(1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇徐州221002；2上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；4徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市第一人民醫(yī)院；5徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市婦幼保健院)

卵巢癌發(fā)病部位隱匿、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床上缺乏早期診斷的方法并且治療效果不佳[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，可獲得早期篩查的指標(biāo)和生物治療靶點(diǎn)。WWOX蛋白是含WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶，WWOX基因是Bednarek等[2]應(yīng)用鳥(niǎo)槍基因測(cè)序技術(shù)分離并鑒定得出的一個(gè)潛在的抑癌基因。WWOX表達(dá)缺失與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān) ，其中包括卵巢癌[3]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)主要步驟，代表了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族在EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。Elf5是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族中具有上皮特異性的一個(gè)成員，調(diào)控細(xì)胞的增殖與腫瘤的發(fā)生[6,7]。本研究觀察了上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織中WWOX蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Elf5 和Snail1、EMT標(biāo)志分子的表達(dá)變化及其表達(dá)的相關(guān)性，分析其表達(dá)與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010～2013年在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市第一人民醫(yī)院及徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市婦幼保健院接受手術(shù)治療的上皮性卵巢癌患者300例[排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、來(lái)自于生殖系統(tǒng)其他器官腫瘤的轉(zhuǎn)移癌(包括原發(fā)性雙癌)及首次治療為化療、放療或內(nèi)分泌等其他抗腫瘤治療者]，年齡17～74歲(≥53歲146例,<53歲154例)。300例患者手術(shù)治療時(shí)均留取卵巢癌組織及其癌組織相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以外的正常組織，經(jīng)病理檢查證實(shí))，石蠟包埋。300例患者具備完整的臨床、病理及隨訪資料(隨訪至患者死亡或至2018年1月，隨訪時(shí)間為6～96個(gè)月)。FIGO分期：早期(Ⅰ期+Ⅱ期)143例，晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)157例；分化程度：高分化+中分化(G1+G2)124例，低分化(G3)176例；病理類(lèi)型：漿液性卵巢癌168例，黏液性卵巢癌63例，子宮內(nèi)膜樣癌54例，透明細(xì)胞癌15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移186例，無(wú)轉(zhuǎn)移114例。本研究經(jīng)過(guò)各醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 試劑 兔抗人WWOX多克隆抗體、兔抗人Snail1多克隆抗體、兔抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人N-cadherin多克隆抗體及以兔抗人Vimentin多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔抗人Elf5多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，超敏兔兩步法檢測(cè)試劑盒(PV-9001)及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 受檢組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1及EMT標(biāo)志分子E-cadherin、N-Cadherin 、Vimentin 檢測(cè)方法 將石蠟包埋的受檢組織標(biāo)本按4 μm厚連續(xù)切片。烤片后浸入二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸鹽高壓抗原修復(fù)。滴加6種抗體稀釋液(均為1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫1 h，加入超敏兔二步法檢測(cè)試劑，37 ℃孵育30 min，DAB顯色。復(fù)染、常規(guī)脫水、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生采用獨(dú)立雙盲法閱片，判定免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(WWOX蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，Elf5表達(dá)于細(xì)胞核，Snail1表達(dá)于細(xì)胞核及胞質(zhì)，E-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜，N-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，Vimentin表達(dá)于細(xì)胞質(zhì))。根據(jù)細(xì)胞著色程度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、黃色計(jì)2分、棕黃色計(jì)3分；根據(jù)細(xì)胞著色范圍計(jì)分：每個(gè)高倍視野觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%計(jì)0分、5%～25%計(jì)1 分、26%～50%計(jì)2 分、51%～75%計(jì)3分、>75%計(jì)4 分，每例標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400倍),取中位值；上述兩分值的乘積為0判為陰性、1～4判為弱陽(yáng)性(+)、5～8判為中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++)、9以上判為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，+～+++均為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析法，組間生存率比較用Log-Rank檢驗(yàn)，多因素分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織及癌旁組織中WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標(biāo)志分子的表達(dá)比較 WWOX蛋白、Elf5和E-cadherin在卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率低、癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)率高，Snail1、N-cadherin、Vimentin在卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高、癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率低；卵巢癌組織及癌旁組織中WWOX蛋白、Elf5、Snail1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)相比，P均< 0.05；詳見(jiàn)表1。

2.2 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標(biāo)志分子的表達(dá)與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1及EMT標(biāo)志分子的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床分期、病理學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡及病理學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)(P均>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標(biāo)志分子的表達(dá)與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5、Snail1、EMT標(biāo)志分子表達(dá)的相互關(guān)系 卵巢癌組織中WWOX蛋白表達(dá)陽(yáng)性的113例中Elf5表達(dá)陽(yáng)性61例、陰性52例，WWOX蛋白表達(dá)陰性的187例中Elf5表達(dá)陽(yáng)性47例、陰性140例，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.291,P<0.05)。另外，卵巢癌組織中WWOX蛋白與 Snail1、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.785、-0.482、-0.706，P均<0.05)，WWOX蛋白與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.759,P<0.05),Elf5與 Snail1、N-cadherin、Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.816、-0.465、-0.738，P均<0.05)，Elf5與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)(r= 0.726,P<0.05)；詳見(jiàn)表3。

2.4 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5表達(dá)與上皮性卵巢癌患者生存及預(yù)后的關(guān)系 本組病例隨訪期間失訪44例，平均5年生存率為22.3%。WWOX蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性者5年生存率分別為42.5%和15.5%,兩者相比，P<0.05； Elf5表達(dá)陽(yáng)性者與陰性者5年生存率分別為46.3%和9.9%,兩者相比，P<0.05。

將上皮性卵巢癌患者的年齡(分為≥53歲組與<53歲組)、病理學(xué)類(lèi)型(漿液性癌組、黏液性癌組、子宮內(nèi)膜樣癌組、透明細(xì)胞癌組)、FIGO分期(分為Ⅰ期+Ⅱ期組與Ⅲ期+Ⅳ期組)、病理學(xué)分級(jí)(G1+G2組與G3組)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分為轉(zhuǎn)移組與無(wú)轉(zhuǎn)移組)、WWOX蛋白表達(dá)(分為陽(yáng)性組與陰性組)、Elf5表達(dá)(分為陽(yáng)性組與陰性組)等因素引入Cox多因素模型分析顯示，WWOX蛋白、Elf5、FIGO分期、病理學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響上皮性卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見(jiàn)表4。

表3 卵巢癌組織WWOX蛋白、Elf5表達(dá)與Snail1及EMT標(biāo)志分子表達(dá)的相關(guān)性(例)

表4 300例上皮性卵巢癌患者預(yù)后影響因素分析結(jié)果

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)都是晚期，手術(shù)以及其他治療均無(wú)法明顯改善卵巢癌患者的預(yù)后[8]。目前卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全確定，因此深入研究卵巢癌的發(fā)生機(jī)制有利于尋找有效的治療方法[9]。WWOX基因是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，WWOX蛋白可以與不同的蛋白(如p73, Ap2, ErbB4, c-Jun等)相互作用，也可以參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(如腫瘤壞死因子受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2介導(dǎo)的凋亡途徑)從而抑制腫瘤的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[10,11]。轉(zhuǎn)錄因子Elf5位于人11號(hào)染色體短臂13～15區(qū)，這個(gè)區(qū)域在癌癥患者中易發(fā)生雜合性丟失[6]， Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Elf5中E3結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸，具有和蛋白質(zhì)結(jié)合的功能，而WWOX蛋白中的WW1結(jié)構(gòu)域能夠與富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，WWOX蛋白通過(guò)此特性可以與Elf5相互作用。Elf5不僅參與細(xì)胞的發(fā)育、分化和凋亡過(guò)程，并調(diào)控細(xì)胞的增殖與腫瘤的發(fā)生[13]。Yan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，WWOX mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)低于正常卵巢組織。Qian等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Elf5 mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)低于正常卵巢組織。本研究發(fā)現(xiàn)，WWOX蛋白和Elf5在卵巢癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均低，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高，說(shuō)明WWOX蛋白和Elf5的低表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。

EMT是卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥發(fā)生中的一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟，是指在某些特殊的生理或病理情況下不能移動(dòng)的具有極性的上皮細(xì)胞被可以移動(dòng)有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞所代替，同時(shí)上皮細(xì)胞擁有間質(zhì)細(xì)胞的表型[16]。EMT過(guò)程的發(fā)生受到多種生長(zhǎng)因子及多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的共同調(diào)節(jié)，如Snail1/E-cadherin信號(hào)通路[17]。在卵巢癌中，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達(dá)增加可以通過(guò)與EMT標(biāo)志分子E-cadherin上的啟動(dòng)子E-box相結(jié)合，抑制 E-cadherin的表達(dá),使細(xì)胞無(wú)法黏附在一起，從而誘導(dǎo)卵巢癌的發(fā)生并產(chǎn)生侵襲性[18]；同時(shí)，EMT間葉性標(biāo)志物N-Cadherin和Vimentin表達(dá)增加，使腫瘤細(xì)胞之間變疏松而容易發(fā)生遷移和擴(kuò)散[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在卵巢癌組織中低表達(dá)，Snail1、N-Cadherin及Vimentin在卵巢癌組織中高表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致，符合卵巢癌EMT過(guò)程中的分子生物學(xué)特征。本研究還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中WWOX蛋白、Elf5表達(dá)越低，EMT現(xiàn)象越嚴(yán)重，臨床上表現(xiàn)為病理學(xué)分級(jí)越高、病理分期越晚、越容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后越差。

總之，本研究結(jié)果表明，上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織中WWOX蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Elf5 和Snail1、EMT標(biāo)志分子的表達(dá)發(fā)生變化，而且其表達(dá)存在相關(guān)性，WWOX蛋白及Elf5的表達(dá)與上皮性卵巢癌患者的生存及預(yù)后相關(guān)。WWOX基因作為抑癌基因，其表達(dá)的缺失可能促進(jìn)了卵巢癌的EMT現(xiàn)象，進(jìn)一步促進(jìn)卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。WWOX也有望成為卵巢癌早期篩查的指標(biāo)以及生物治療的新靶點(diǎn)。然而卵巢癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制是多步驟、多基因調(diào)控的過(guò)程，WWOX抑制卵巢癌的EMT過(guò)程的具體機(jī)制還有待于更深入的研究。