宮頸癌組織中卵泡抑素樣蛋白1的表達(dá)變化及其意義

洛若愚,張紅,,胡曉霞,毛林,劉珍,米思倩

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院,武漢430000；2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在我國，每年宮頸癌新發(fā)病例約有10 萬，約占世界新發(fā)病例總數(shù)的20%，且近年來有地區(qū)性增長及年輕化的趨勢[1, 2]。宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(HPV)感染關(guān)系密切，但有研究[3]證實(shí)，單一的HPV感染不足以導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，某些基因和免疫因素也發(fā)揮了重要作用。研究[4～9]表明，卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[4～7]，然而FSTL1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前未見報道。本研究對宮頸癌組織中的FSTL1 mRNA及蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，并對其表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)、生存時間的關(guān)系進(jìn)行了分析，探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年9月～2017年6月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院接受手術(shù)治療(術(shù)前未接受輔助治療)的部分宮頸癌患者(共140例,其中21例既檢測FSTL1 mRNA，又檢測FSTL1 蛋白)，術(shù)中均留取癌組織，有62例同時留取癌旁組織(取材時應(yīng)距腫瘤邊緣盡可能遠(yuǎn)，至少大于0.5 cm，28例檢測FSTL1 mRNA，34例檢測FSTL1蛋白)。有77例宮頸癌患者的癌組織用于FSTL1 mRNA的檢測，其中年齡≥50歲者39例、<50歲者38例；鱗癌60例，腺癌15例，混合癌1例及子宮內(nèi)膜樣腺癌1例；腫瘤高分化19例，中分化32例，低分化26例；腫瘤最大直徑>4 cm者20例、≤4 cm者57例；FIGO分期ⅠB期48例、Ⅱ期20例、≥Ⅲ期9例；腫瘤浸潤深度占宮頸壁全層的百分比>50% 者44例、≤50%者33例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者58例；有血管浸潤者30例，無血管浸潤者47例；有神經(jīng)浸潤者7例，無神經(jīng)浸潤者70例；癌灶累及子宮及附件者22例，未累及子宮及附件者55例。有84例宮頸癌患者的癌組織用于FSTL1 蛋白的檢測，其中年齡≥50歲者36例、<50歲者48例；鱗癌70例，腺癌14例；腫瘤高分化18例，中分化48例，低分化18例；腫瘤最大直徑>4 cm者10例、≤4 cm者74例；FIGO分期ⅠB期61例、Ⅱ期23例；腫瘤浸潤深度占宮頸壁全層的百分比>50%者52例、≤50%者32例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69例；有血管浸潤者44例，無血管浸潤者40例；有神經(jīng)浸潤者7例，無神經(jīng)浸潤者77例；癌灶累及子宮及附件者39例，未累及子宮及附件者45例；術(shù)后均接受電話隨訪。另取正常宮頸組織44例份作對照(22例份用于FSTL1 mRNA檢測，22例份用于FSTL1 蛋白檢測)，分別來自子宮脫垂患者5例、子宮內(nèi)膜異位癥患者19例、子宮肌瘤患者20例。

1.2 受檢組織中FSTL1 mRNA的檢測方法 采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)。用TRIzol試劑(Invitrogin 公司)按說明書提取受檢組織總RNA，經(jīng)37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)。以GAPDH基因作為內(nèi)參。參照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書，經(jīng)95 ℃預(yù)變性15 min，40個循環(huán)(95 ℃ 10 s 、60 ℃ 32 s)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用 2-△△Ct表示受檢組織中FSTL1 mRNA的相對表達(dá)量。FSTL1基因上、下游引物分別為5′-GAGGGCAAGAGTACACCA-3′和5′-TACGGCATAGACGACAGC-3′，GAPDH基因上、下游引物分別為 5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′和5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′；引物由Primer Bank設(shè)計，美國Invitrogen公司合成。

1.3 受檢組織中FSTL1蛋白的檢測 受檢組織石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟、水化。采用免疫酶標(biāo)法(即用型二步法)染色，檸檬酸鈉高溫高壓修復(fù)抗原，3%H2O2去內(nèi)源性過氧化物酶。滴加一抗FSTL1(1∶250,Abcam公司)4 ℃過夜，二抗酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)37 ℃孵育20 min，DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色，蒸餾水終止，蘇木素(北京索萊寶科技有限公司)復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水反藍(lán)，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。鏡下觀察封片，計算每個高倍鏡(200×)視野中FSTL1蛋白陽性(胞核和胞質(zhì)呈現(xiàn)不同程度的淺黃色或褐色，以胞核為主)細(xì)胞所占比例，陽性細(xì)胞 0～25%計1分、>25%～50%計2分、>50%～75%計3分、>75%～100%計4分；細(xì)胞不著色為陰性計0分，弱陽性(淺黃色)計1分，中陽性(棕黃色)計2分，強(qiáng)陽性(棕褐色)計3分[8]；最終免疫反應(yīng)評分為FSTL1蛋白陽性細(xì)胞所占比例與陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度之和。以宮頸癌組織最終免疫反應(yīng)評分中位數(shù)為界，將84例宮頸癌患者分為癌組織FSTL1蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組，并分析宮頸癌組織FSTL1蛋白表達(dá)量對患者術(shù)后生存時間的影響。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織、宮頸癌旁組織和正常宮頸組織中FSTL1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較 宮頸癌組織、宮頸癌旁組織、正常宮頸組織中FSTL1 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.36±0.05、2.15±0.40、2.52±0.50，F(xiàn)STL1蛋白的表達(dá)量分別為(3.33±0.24)、(4.76±0.25)、(5.41±0.22)分；宮頸癌組織中的FSTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)量與宮頸癌旁組織及正常宮頸組織中的表達(dá)量相比，P均<0.05；宮頸癌旁組織中FSTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)量與正常宮頸組織相比，P均>0.05。

2.2 宮頸癌組織中FSTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)量與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系 宮頸癌組織中，F(xiàn)STL1 mRNA的表達(dá)量與腫瘤大小、浸潤深度、分化程度以及FIGO分期有關(guān)(P均<0.05)， FSTL1蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤大小有關(guān)(P均<0.05)，F(xiàn)STL1 mRNA和蛋白的表達(dá)與患者年齡、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、血管浸潤等無關(guān)(P均>0.05)，見表1。

表1 FSTL1的表達(dá)量與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：*為腫瘤浸潤深度占宮頸壁全層的百分比。

2.3 宮頸癌組織中FSTL1蛋白表達(dá)與宮頸癌患者生存時間的關(guān)系 84例接受宮頸癌組織FSTL1蛋白檢測的宮頸癌患者中FSTL1蛋白低表達(dá)45例、高表達(dá)39例。此84例患者術(shù)后電話隨訪2～36個月(中位隨訪時間為23個月)，其中失訪11例、死亡2例、復(fù)發(fā)3例。宮頸癌組織中FSTL1蛋白高表達(dá)和低表達(dá)者的總體生存時間(分別為26、20個月)和無瘤生存時間(分別為21、27個月)相比，P均>0.05。

3 討論

FSTL1蛋白是一種分泌性糖蛋白，除外周淋巴細(xì)胞以外，幾乎所有的哺乳動物細(xì)胞均有FSTL1的表達(dá);FSTL1基因定位于人的3q13.33染色體，由308個氨基酸構(gòu)成，其相對分子質(zhì)量約為35 kDa。FSTL1含有1個卵泡抑素樣結(jié)構(gòu)域(FS)和1個細(xì)胞外鈣離子結(jié)合區(qū)域(EC)，EC結(jié)構(gòu)域其后緊相連的C端存在與血友因子(VWC)同源性的結(jié)構(gòu)域，屬于SPARC家族蛋白之一。FSTL1在大多數(shù)腫瘤如鼻咽癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[4]、卵巢癌[4]、肺癌[9]中表達(dá)下調(diào)，Chan等[4]發(fā)現(xiàn)FSTL1在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)STL1 mRNA和蛋白在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中也表達(dá)下調(diào)[10]。FSTL1在結(jié)腸癌上皮細(xì)胞胞質(zhì)中、癌旁組織中、患者血漿中表達(dá)均上調(diào)[5]，在食管鱗癌[11]、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤[12]和前列腺癌[13]中表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中FSTL1 mRNA及蛋白的相對表達(dá)量明顯低于宮頸癌旁組織及正常宮頸組織。推測FSTL1可能作為抑癌基因參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，后續(xù)我們將進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

有研究[4, 5, 7]顯示FSTL1的異常表達(dá)與患者的臨床病理關(guān)系密切。Chan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1 mRNA低表達(dá)不僅與非內(nèi)膜樣腺癌、低分化、浸潤深肌層、侵犯宮頸間質(zhì)以及淋巴脈管轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者呈正相關(guān)，還與低分化、雙側(cè)卵巢腫瘤、包膜完整的卵巢癌患者呈正相關(guān)。另有文獻(xiàn)[5]報道，F(xiàn)STL1蛋白表達(dá)量與結(jié)腸癌患者的腫瘤大小、分級、分期及患者性別沒有相關(guān)性。然而，Yang等[14]分析肝癌患者組織中FSTL1 mRNA的表達(dá)量上調(diào)，F(xiàn)STL1 mRNA的高表達(dá)與巨大塊肝癌、晚期肝癌、門靜脈的侵犯及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL1 mRNA的高表達(dá)提示患者的術(shù)后生存時間相對越短，F(xiàn)STL1可作為一個術(shù)后獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中FSTL1 mRNA的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度、分化程度以及FIGO分期有關(guān)，F(xiàn)STL1蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度和腫瘤大小有關(guān)。這表明FSTL1具有雙向調(diào)控機(jī)制，在不同腫瘤中FSTL1的異常表達(dá)與其臨床病理參數(shù)關(guān)系有所不同，發(fā)揮著不同的作用。本研究表明FSTL1的低表達(dá)與宮頸癌患者的癌組織的浸潤深度、分化程度及FIGO分期密切相關(guān)，檢測FSTL1的表達(dá)，有助于我們判斷疾病的嚴(yán)重程度，確定最佳的治療方案及術(shù)后預(yù)后情況。另外我們還發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中FSTL1蛋白高表達(dá)者和低表達(dá)者的總體生存時間和無瘤生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與樣本量少、隨訪時間短有關(guān)，后續(xù)我們會增加隨訪時間，進(jìn)一步探討FSTL1與患者預(yù)后的關(guān)系。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中FSTL1 mRNA 和蛋白均呈低表達(dá)，觀察癌組織中FSTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)有助于判斷宮頸癌浸潤深度、分化程度及FIGO分期，F(xiàn)STL1可能作為抑癌基因參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。