體內(nèi)外受精及玻璃化冷凍對小鼠胚胎體外發(fā)育的影響

鄧星，段超群，黎興盛，袁照清，李清，劉珍，韓艷

(江西省宜春市婦幼保健院輔助生殖科，宜春 336000)

自1978年世界上首例“試管嬰兒”路易斯.布朗在英國誕生以來，人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)發(fā)展迅速，迄今為止，全世界已經(jīng)有大約500萬例試管嬰兒出生[1]。人類ART的成功依賴臨床和胚胎實驗室的緊密配合，其中實驗室質(zhì)量控制的好壞直接影響到配子的結(jié)合和受精卵的發(fā)育，進而影響到體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的成功率[2]，我國人類體外受精胚胎移植實驗室操作專家共識（2016版）規(guī)定新裝修胚胎培養(yǎng)室啟用前需要用鼠胚試驗(mouse embryo assay，MEA)，要求囊胚形成率在75%-80%為合格[3]，鼠胚試驗合格后才能投入使用。此外，玻璃化冷凍技術(shù)因其簡單快速有效，并且在復(fù)蘇率和囊胚孵出率等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)程序冷凍技術(shù)而被廣泛應(yīng)用。玻璃化冷凍技術(shù)提高了每次促排卵/取卵周期的累計妊娠率[4]。本研究擬分別對體內(nèi)、體外完成受精過程的昆明小白鼠受精卵體外培養(yǎng)至第5d，觀察其卵裂率、囊胚率；并對囊胚進行玻璃化冷凍及繼續(xù)培養(yǎng)，比較囊胚冷凍與否孵出率的差異，以對我院新建胚胎培養(yǎng)室的環(huán)境和培養(yǎng)體系進行檢測，為本單位順利開展人類胚胎體外培養(yǎng)提供可靠的實驗依據(jù)和質(zhì)量控制保證。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司的6-8周齡昆明白雌鼠；選擇年齡盡可能大的雄鼠(10周)。光照制度：或者12h黑暗，12h光照。室內(nèi)溫度為20-26℃。雄鼠單籠飼養(yǎng)，雌鼠集中飼養(yǎng)，保證飼養(yǎng)密度不低于100cm2/只，自由飲水采食，飼料為小鼠繁殖料。PMSG（由杭州動物藥品廠提供）500IU/支（使用特定稀釋液將PMSG稀釋成100IU/ml）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）500IU/支（使用注射用水將HCG稀釋成100IU/ml）、Vitrolife序貫培養(yǎng)液（瑞典）、、冷凍解凍液（VT101，VT102），載桿購自日本加藤公司。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的獲取 體內(nèi)受精卵的獲取：分批次(3只為一批次)對健康的雌性小鼠在統(tǒng)一的時間(17：00)進行腹腔PMSG10IU(0.1ml)注射；注射48h后進行HCG 10lU(0.1ml)注射。然后按照雄鼠：雌鼠1：1的比例將雌雄小鼠合籠，若隔日晨見陰道栓則交配成功。隨后處死雌鼠，取出輸卵管，在體顯微鏡下取出受精卵，對獲取的受精卵洗滌并脫顆粒細(xì)胞后將每個微滴放10個受精卵置于卵裂培養(yǎng)皿中，6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。體外受精卵的獲取：分批次采用上述體內(nèi)受精所述的方法注射雌鼠，HCG注射后隔日早8：30處死雌鼠，同上述的方法處理輸卵管，通過輕輕擠壓方式獲得卵冠丘復(fù)合物，對獲取的卵冠丘復(fù)合物進行洗滌后置于受精皿中，每個微滴放10個受精卵將其放置到培養(yǎng)箱中。隨后，采集雄鼠的附睪尾精液利用微滴受精法進行體外受精。

1.2.2 囊胚的玻璃化冷凍復(fù)蘇 冷凍：胚胎置于平衡液中5-15min（不可超過15min），此過程內(nèi)可見細(xì)胞皺縮后重新擴張。將胚胎轉(zhuǎn)入冷凍液，至少于3個不同液滴多次吸放胚胎，以便充分清洗除去平衡液。將胚胎轉(zhuǎn)到冷凍載桿上，每管1-3枚胚胎。盡量減少殘留冷凍液的體積，約1-2μl為佳。迅速將載桿浸入液氮中。注意胚胎與冷凍液接觸時間不可超過1min。復(fù)蘇：將冷凍載桿插入復(fù)蘇1液中，可見胚胎從載桿脫落至復(fù)蘇1液。胚胎于復(fù)蘇1液中停留1min，依次轉(zhuǎn)至復(fù)蘇2液3min及復(fù)蘇3液5min，最后于復(fù)蘇4液中平衡5min，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h記錄囊胚孵出情況。

1.3 觀察指標(biāo) 本次實驗中觀察的指標(biāo)包括：卵裂率、囊胚率、囊胚孵出率。根據(jù)Gardner[5]等綜合囊胚擴張狀態(tài)，內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育對囊胚的質(zhì)量進行全面評定。囊胚評分4期，內(nèi)細(xì)胞團及滋養(yǎng)層為B級以上的胚胎用于本實驗研究。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本次研究采用了SPSS 21.0進行分析，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較體內(nèi)、外受精小鼠胚胎的體外發(fā)育情況體內(nèi)受精昆明白小鼠共進行了9個批次試驗，結(jié)果見表1。體外受精昆明白小鼠共進行了8個批次試驗，結(jié)果見表2。

體內(nèi)、體外受精獲得的卵裂率和囊胚形成率經(jīng)卡方檢驗，P值均大于0.05，即2-細(xì)胞率和囊胚形成率在體內(nèi)受精組與體外受精組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 比較新鮮囊胚與冷凍囊胚的孵出率 玻璃化冷凍組與未冷凍組的囊胚孵出率差別并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 實驗結(jié)果見表 3。

表1 昆明白小鼠體內(nèi)受精胚胎體外發(fā)育

表2 昆明白小鼠體外受精胚胎體外發(fā)育情況

表3 囊胚冷凍與否的孵出率

3 討論

胚胎實驗室是人類輔助生殖技術(shù)順利實施的重要部分，是保證ART成功的重要核心條件。質(zhì)量控制在體外受精及胚胎培養(yǎng)的過程中有著至關(guān)重要的作用。而囊胚培養(yǎng)及玻璃化冷凍技術(shù)也是現(xiàn)代輔助生殖技木不可缺少的部分。文獻報道，體外延長培養(yǎng)能有效篩選具有發(fā)育潛力的胚胎，優(yōu)質(zhì)囊胚形成與D2、D3胚胎的卵裂球數(shù)及碎片評級密切相關(guān)[6]。鼠胚實驗分析(MEA)適用于新建的IVF實驗室質(zhì)控[7]。

體內(nèi)受精法采集2-細(xì)胞胚胎，該方法雖穩(wěn)定簡單，但其不能良好地評價配子及受精卵對培養(yǎng)所用的試劑耗材的敏感性，不能對體外受精的全過程和實驗操作人員進行全面評價及發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)體系中存在的問題[8]。受精在輔助生殖技術(shù)中是極為重要的，是精子和卵子相互作用的結(jié)果[9]。且已有的研究結(jié)果顯示1-細(xì)胞鼠胚胎比2-細(xì)胞鼠胚胎對胚胎發(fā)育的影響更敏感，更有利于檢測出不利因素對胚胎發(fā)育的影響[10]。所以，我們將兩種方法結(jié)合，對胚胎實驗室進行了全面的質(zhì)量控制，得到了較好的結(jié)果，體內(nèi)外受精體外胚胎培養(yǎng)2細(xì)胞率，囊胚形成率差別并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），符合IVF-ET實驗室的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[11]。

近年來，在輔助生殖領(lǐng)域中玻璃化冷凍技術(shù)廣泛應(yīng)用于胚胎及卵母細(xì)胞[12]。該技術(shù)以其簡便、高效等優(yōu)勢逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)程序化冷凍，大量研究證實玻璃化冷凍技術(shù)能夠高效地保存人類胚胎[13，14]。我們的實驗結(jié)果表明，玻璃化冷凍囊胚復(fù)蘇后的孵出率與未冷凍的囊胚孵出率的差別并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），一方面可以說明我們實驗室的玻璃化冷凍技術(shù)并未對胚胎孵出造成不利的影響；另一方面說明本實驗室的培養(yǎng)環(huán)境適合胚胎發(fā)育，同時也可以證明實驗室的質(zhì)量控制和技術(shù)員的操作水平達(dá)到了實施IVF實驗室的要求。

我們實驗使用小鼠體內(nèi)受精和體外受精這兩種方法獲得受精胚，進行胚胎培養(yǎng)發(fā)育到囊胚以及對囊胚進行玻璃化冷凍，作為實驗室培養(yǎng)體系監(jiān)測評價指標(biāo)，為完成人類輔助生殖技術(shù)的安全有效的實施提供保障。