特異性抑制內向整流性鉀電流對缺血再灌注心臟的保護作用

黃蕓，翁俊美，孟一迪，徐秋梅，聶大安，李子進，劉杰，李景東，姚東曉

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院：1老年病科，2心血管內科，3神經外科，武漢 430022)

冠心病心肌缺血和急性心肌梗死可導致心臟重構、心力衰竭和心律失常[1,2]。心肌再灌注治療是最有效的治療方法之一，但有導致再灌注損傷的不利作用[3,4]。缺血預適應可通過再灌注損傷補救激酶激活等機制，減輕心肌再灌注損傷[5,6]。內向性整流性鉀電流(inward rectifier potassium current，IK1)在心肌缺血時下調，并在心肌細胞缺血預適應模型中起著重要作用[7,8]。長期以來，因無特異性的心臟IK1抑制劑，對其下調與缺血預適應和再灌注損傷的關系尚未闡明。為此，本研究選用轉基因抑制心臟IK1小鼠，建立心臟缺血預適應模型，研究特異性抑制心臟IK1在缺血預適應時是否具有減輕再灌注損傷的作用及其機制，可望為開發新一代特異性心臟IK1抑制手段治療冠心病心肌缺血提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與液體配制

轉基因心臟IK1抑制小鼠(Kir2.1-AAA)由美國Michigan大學Anatoli N. Lopatin贈送，小鼠飼養于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心SPF級(無特定病原體級實驗動物，Specific Pathogen Free)環境中。Kir2.1-AAA轉基因鑒定引物序列：正向為5′-CTGTGTCGACATCCGCTGGAGGTGG-3，反向為5′-CCCACTCTCCACATCAAGCAGAGTT-3′，其聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)產物為420 bp，將此條帶測序，陽性者為GYG突變為AAA。實驗取3～6個月齡小鼠，體質量18～25 g，分為觀察組(n=9)和對照組(n=12)，雌雄比例相同。

Langendorff離體心臟灌流液：KHB(Krebs-Henseleit bicarbonate)溶液配制1 L需要氯化鈉6.89 g、氯化鉀0.35 g、碳酸氫鈉2.1 g、硫酸鎂0.144 g、磷酸二氫鉀0.144 g、氯化鈣0.368 g、乙二胺四乙酸鈉(EDTA Na)0.416 g、葡萄糖2.702 g、丙酮酸鹽2.703 g，濃鹽酸調整pH=7.35。1%氯代三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)磷酸緩沖液：每100 ml含1 g TTC、88 mmol/L Na2HPO4和1.8 mmol/L NaH2PO4，pH=7.8。

1.2 方法

1.2.1 體表心電圖 麻醉小鼠后，以溫控小電熱毯保持其體溫在36℃～37℃，利用RM6240數據采集分析系統(成都儀器公司)持續記錄基礎狀態下小鼠心電圖5 min，測量心率(heart rate，HR)、PR間期和QRS間期，并監測心律失常發生情況。

1.2.2 心臟缺血預適應模型的建立 用1%戊苯巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，從主動脈遠端分離心臟并連接至Langendroff灌流裝置，以95%O2和5%CO2的混合氣體持續沖入(37.0±0.5)℃的KHB液，先穩定10 min，缺血2 min，灌注5 min，2個循環，然后全心缺血20 min，再灌注45 min。實驗結束后，取心臟-80℃保存。

1.2.3 心律失常檢測 將3個Ag+/AgCl電極分別置于心臟心尖部和左右兩側形成 Einthoven三角，記錄離體心臟心電圖。心律失常評分標準為：無心律失常(0分)，房早或室早(1分)，室上速或成對室性早搏或T波電交替(2分)，室早呈三聯率或呈短陣≥3個但≤10個(3分)，持續室速(定義為室早≥10個)或多行性室速或尖端扭轉性室速(4分)[9]。

1.2.4 心肌梗死面積測定 取冷凍心臟，橫切成約2 mm薄片5層，置入1% TTC磷酸緩沖液(pH 7.4)中37℃孵育20 min。梗死區呈灰白色，非梗死區呈深紅色。拍照后，以ImageJ2x軟件測定心肌梗死面積。

1.2.5 Tunel凋亡檢測 灌流結束后將心臟置入4%的甲醛磷酸鹽緩沖液，固定48 h，石蠟包埋心臟組織，切片，采用Roche的Insitucell death定量藥盒檢測。凋亡指數(‰)=凋亡心肌細胞核數/正常心肌細胞核數×1000‰。

1.2.6 Western blotting 取心臟左心室，檢測樣本濃度，15 μg/孔上樣，SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉，Ⅰ抗的稀釋度為1∶1000，4℃孵育過夜。相應Ⅱ抗室溫孵育2 h后，暗室曝光。蛋白條帶相對濃度用Lab Image軟件測定。Ⅱ抗包括p-AKT、AKT、p-GSK3β和GSK3β。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 轉基因陽性小鼠鑒定及基因檢測結果

Kir2.1-AAA轉基因陽性與陰性PCR片段均顯示420 bp條帶(圖1A)。陰性者顯示KCNJ2孔道區為GGCTATGGT(編碼相應氨基酸為GYG)，陽性為GCCGCTGCT(AAA)，見圖1B。

2.2 基礎狀態下2組小鼠的體表心電圖

基礎狀態下觀察組(n=9)和對照組(n=12)的HR分別為(446.4±35.9)和(463.6±46.8)次/min，PR間期分別為(53.58±12.32)和(52.15±13.23)ms，QRS間期分別為(22.95±17.33)和(21.5±16.67)ms，2組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖1 PCR檢測結果

2.3 Kir2.1-AAA對小鼠心律失常的影響

與對照組(n=12)相比，觀察組(n=9)心律失常評分分值顯著降低[(3.50±0.67)vs(7.42±0.70)分，P<0.01]，提示抑制 IK1可減少缺血致心律失常的發生。

2.4 Kir2.1-AAA對小鼠心肌梗死面積的影響

與對照組(n=10)相比，觀察組(n=8)小鼠心肌梗死面積/左室面積的比值顯著減少[(0.25±0.04)%vs(0.38±0.02)%，P<0.05]。

2.5 Kir2.1-AAA對小鼠心肌細胞凋亡的影響

與對照組(n=7)相比，觀察組(n=8)小鼠心肌細胞凋亡指數顯著降低[(202±93)‰vs(822.5±97.5)‰，P<0.001]，提示特異性抑制IK1具有減緩心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的作用。

2.6 Kir2.1-AAA對再灌注損傷補救激酶信號通路關鍵分子蛋白表達的影響

GSK3相對表達量在觀察組和對照組中分別為(0.79±0.11)和(0.77±0.15)，2組間差異無統計學意義(P>0.05)，但觀察組磷酸化糖原合成酶激酶3(phosphorylated glycogensynthaseldnase 3，p-GSK3)相對表達量顯著高于對照組[(1.41±0.16vs(0.77±0.05)，P<0.05]，提示p-GSK3可能介導了Kir2.1-AAA對缺血再灌注心臟的保護作用(圖2A)。此外，觀察組中無論是AKT[(1.84±0.20)vs(0.81±0.14)]還是P-AKT[(1.87±0.27)vs(1.08±0.22)]的表達均顯著高于對照組(P<0.01)，提示AKT和P-AKT均可能介導了抑制IK1對缺血再灌注心臟的保護作用(圖2B)。

圖2 Kir2.1-AAA對RISK信號通路關鍵分子蛋白表達的影響

3 討 論

冠心病及其并發癥嚴重威脅著人類的生命與健康[2]，IK1在冠心病心力衰竭時下調，在心臟重構過程中起著重要作用[10,11]。近年來，隨著溶栓和介入技術的廣泛應用，心肌缺血再灌注損傷越來越受到關注，缺血預適應可改善心肌缺血再灌注損傷，但其機制尚待深入研究[6]。本研究采用轉基因特異性抑制IK1小鼠建立缺血預適應模型，結果發現特異性抑制IK1可以改善缺血預適應對缺血再灌注損傷的保護作用，減少心律失常發生以及心肌細胞凋亡和心肌梗死面積。

本研究結果表明，IK1抑制小鼠在離體心臟缺血再灌注模型缺血預適應后，其心律失常明顯少于對照組小鼠。理論上講，特異性抑制IK1既可能抑制也可能促進心律失常的發生，因為抑制IK1會降低靜息膜電位的穩定性，促進除極化，使自律性增加[12]。但抑制IK1又可均一地延長動作電位時間和不應期，降低心室復極離散度而防止折返形成，延緩異常興奮的傳播，從而具有抗心律失常作用[13]。高血壓性心肌肥大、心肌病及各種原因所致的心力衰竭均伴有IK1下調[14]，過度表達IK1的小鼠表現為心律失常及心臟肥大等異常[15]。本研究結果也證實了均一特異性抑制IK1具有抗心律失常的作用。

本研究表明，轉基因抑制IK1可減少心肌梗死面積和心肌細胞凋亡。研究表明，缺血預適應會引起再灌注損傷補救激酶的激活，包括PI3K/Akt/GSK3β和Erk1/2通路的活化，再進一步激活或抑制下游信號分子包括酶代謝、凋亡分子等，抑制有害的線粒體膜通透性轉換，從而保護心肌[16]。本研究結果顯示，Akt蛋白與GSK3β蛋白在觀察組(IK1抑制)的表達量高于對照組，提示抑制IK1可能加大激活這些信號傳導的級聯反應。值得提出的是，在文獻[17]報道的與本研究相同的模型中，缺血預適應對野生型小鼠(本研究中的對照組)心臟本身即具有保護作用，因而本研究發現的特異性抑制IK1帶來的有益作用至少部分是額外的協同作用。

綜上所述，本研究結果證實特異性抑制IK1可保護缺血心臟。在離體心臟缺血再灌注模型缺血預適應后，轉基因特異性抑制IK1小鼠相比野生型小鼠在抗心律失常方面具有明顯優勢，并且可減少心肌梗死范圍、抗細胞凋亡，但對其具體分子機制還有待進一步研究。本研究可望為未來治療缺血性心臟病提供新的理論依據。