MTSase和MTHase在Brevibacillus brevis中的克隆表達及應用研究

吳世雄 ， 宿玲恰 ， 姚鍇琳 ， 吳 敬 ， 吳 丹 *

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase，MTSase，EC5.4.99.15）和麥芽寡糖基海藻糖水解 酶 （maltooligosyltrehalose trehalohydrolase ，MTHase，EC3.2.1.141）分別由基因treY和treZ編碼，是雙酶法生產海藻糖的關鍵酶[1-4]。在用麥芽寡糖或直鏈淀粉合成海藻糖的過程中，MTSase首先作用于底物還原性末端的Cl-OH，產生α-1，4-糖苷鍵到 α，α-1，1-糖苷鍵的分子內轉糖基作用，形成中間產物麥芽寡糖基海藻糖；MTHase則專一地內切該中間產物中麥芽寡糖基與海藻糖相連的 α-1，4-糖苷鍵，釋放出海藻糖[5]。

海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于自然界中，多種生物體內都含有該糖[6-7]。海藻糖通過保護生物膜和蛋白質等大分子不被變性失活，來維持生命體的生物特征和生命過程[8-9]。外源性的海藻糖對蛋白質、生物膜等大分子同樣具有良好的保護作用，使得海藻糖可作為生物以及醫學領域的活性大分子的保護劑，代替血漿蛋白作為蛋白質、疫苗藥物等生物活性物質的穩定劑[10-15]。同時海藻糖的功能特性在食品加工領域也具有優越表現，如對酸和熱的高度穩定性、抑制脂肪酸敗等[6-7]。正是因為海藻糖具有特殊的理化性質和功能，因此被廣泛用于醫藥業、食品、化妝品等行業。

海藻糖的制備方法主要有天然生物提取法[16]、化學合成法[6]、微生物發酵法[17]、基因工程法[18]和酶轉化法[19]，而酶轉化法以其低成本和高轉化率的特點成為目前制備海藻糖的主要方法[20]。酶轉化法又分為磷酸化酶法、海藻糖合成酶法、麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶雙酶法[21]。

本研究首次將（Sulfolobus acidocaldarius）ATCC 33909來源的麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶在Brevibacillus brevis中進行了克隆表達，在此基礎上探究了雙酶法制備海藻糖的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 菌株E.coli JM109和Brevibacillus brevis由本實驗室保藏；質粒pSVN、pET-24a（+）-treY 和 pET-24a（+）-treZ 由本實驗室保藏。

1.1.2 酶及主要試劑 EcoR I、Hind III限制性內切酶，T4 DNA ligase，PrimerStar Taq DNA 聚合酶，dNTPs，新霉素均購自上海寶生物；DNA純化試劑盒購自上海生工；普魯蘭酶、CGTase為本實驗室所有；蛋白胨、酵母粉、多聚蛋白胨、牛肉浸膏購自Oxiod（英國）公司；其他試劑均為國產分析純，購自國藥集團。

1.1.3 培養基 SOB培養基（g/L）：蛋白胨20.0，酵母 粉 5.0，MgCl2·6H2O 2.0，NaCl 0.5，KCl 0.19，pH 7.0。

LB 培養基（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，pH 7.0（固體培養基加 1.5%～2.0%的瓊脂粉）。

TM液體培養基（g/L）：多聚蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉2.0，無水葡萄糖10.0，微量元素液10 mL，pH 7.2。

TM固體培養基（g/L）：多聚蛋白胨10.0，牛肉浸膏5.0，酵母粉2.0，無水葡萄糖 10.0，微量元素液10 mL，MgCl2·6H2O 4.1，瓊脂粉 20.0，pH 7.2。

微 量 元 素 液 （g/L）：FeSO4·7H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 5.25，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl22.0，（NH4）6Mo7O240.1。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 按照treY和treZ基因序列，按照引物設計原則用引物設計軟件DNAMAN設計了以下引物（下劃線部分分別為EcoR I和Hind III酶切位點）。

treY（EcoR I、Hind III）

F1： 5′-CGGAATTCATGATTAGCGCGACCTAT CG-3′28 bp

R1： 5′-CCAAGCTTACATACGCACCAGGATA C-3′26 bp

treZ（EcoR I、Hind III）

F2： 5′-CGGAATTCATGTTTAGCTTTGGCGGC AA-3′28 bp

R2： 5′-CCAAGCTTATTCCAGTTGATACACG C-3′26 bp

1.2.2 PCR獲得treZ基因片段 分別以pET-24a（+）-treY 和 pET-24a（+）-treZ 為模板，F1/F2、R1/R2為正反向引物擴增treY和treZ基因片段。PCR參數：94℃ 預變性 4 min；進入 PCR循環：98℃ 變性10 s，55 ℃ 退火 5 s，72 ℃延伸 2 min 20 s或 2 min，30個循環；最后72℃10 min，4℃ 保溫。

1.2.3 目的基因的克隆及鑒定 將1.2.2節所得到的基因片段與經EcoR I和Hind III酶切純化后的載體pSVN，用 T4 DNA ligase 4℃ 連接 16 h。連接產物轉化克隆宿主E.coli JM109涂布LB固體培養基 （含10 μg/mL新霉素），30℃ 培養箱培養 10 h，挑取單菌落，經LB液體培養基（含10 μg/mL新霉素）30℃ 培養8 h后，收集菌體抽提質粒，送測序公司測序。測序正確的質粒電轉化表達宿主Brevibacillus brevis，涂布TM 固體培養基（含10 μg/mL新霉素），30℃ 培養箱培養12 h，挑取單菌落，經TM液體培養基（含10 μg/mL新霉素）30℃ 培養10 h后保甘油菌。

1.2.4 重組菌的搖瓶發酵及重組蛋白的SDSPAGE分析

（1）重組菌的搖瓶發酵：分別取 20 μL甘油管保存的重組菌Brevibacillus brevis/pSVN-treY和Brevibacillus brevis/pSVN-treZ接種于 10 mL TM液體培養基（含 10 μg/mL 新霉素）中，30 ℃，200 r/min振蕩培養過夜，取0.5 mL培養液轉接到 50 mL TM 液體培養基 （含10 μg/mL新霉素）中30℃，200 r/min振蕩培養48 h。發酵結束后，8 000 r/min離心15 min收集菌體。

（2）高壓勻漿破碎細胞：將菌體沉淀中加入一定量的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液重懸菌體，用高壓勻漿細胞破碎儀破碎細胞，8 000 r/min離心 15 min，收集上清液。

（3）重組蛋白的SDS-PAGE分析：細胞破壁上清液經SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組蛋白酶活力測定 將麥芽五糖溶解于20 mmol/L pH 6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液中，配成1%的麥芽五糖溶液，取0.49 mL該溶液，加入10 μL MTSase粗酶液，60℃ 反應2 h，100℃沸水中煮10 min 終止反應，DNS 法[2，22]測酶活。 MTSase 的酶活單位定義為每1 min水解1 μmol麥芽五糖生成麥芽三糖基海藻糖所需的酶量[2]。

將麥芽五糖溶解于20 mmol/L pH 6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液中，配成1%的麥芽五糖溶液，取0.48 mL該溶液，加入10 μL濃縮的MTSase酶液，60℃ 反應2 h，100℃沸水中煮10 min終止反應，得到麥芽三糖基海藻糖的水溶液，待溶液冷卻后，加入 10 μL MTHase粗酶液，60℃ 反應 10 min，100℃沸水中煮 10 min終止反應，DNS法[2，22]測酶活。MTHase的酶活單位定義為每1 min水解麥芽三糖基海藻糖生成1 μmol海藻糖所需的酶量[2]。

1.2.6 雙酶法制備海藻糖的條件優化 本研究以馬鈴薯淀粉為底物，經液化處理后于恒溫水浴搖床進行酶轉化實驗。

（1）普魯蘭酶對海藻糖制備的影響。用質量濃度為200 g/L馬鈴薯淀粉經液化，加入MTSase 80 U/g淀粉和MTHase 20 U/g淀粉，分別加入5 U/g淀粉的普魯蘭酶和不加普魯蘭酶，pH 5.5，60℃恒溫水浴搖床，150 r/min，反應48 h。HPLC檢測酶轉化產物。

（2）MTSase和MTHase加酶量對海藻糖制備的影響。用質量濃度為200 g/L馬鈴薯淀粉經液化，分別加入①MTSase 40 U/g 淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g淀粉；②MTSase 60 U/g淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g 淀粉；③MTSase 80 U/g 淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g 淀粉； ④MTSase 100 U/g 淀粉、MTHase 10、20、40、60 U/g 淀粉；加入普魯蘭酶 5 U/g淀粉，pH 5.5，55℃恒溫水浴搖床，150 r/min，反應48 h。HPLC檢測酶轉化產物。

（3）溫度對海藻糖制備的影響。用質量濃度為200 g/L馬鈴薯淀粉經液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普魯蘭酶5 U/g淀粉，pH 5.5，50、55、60、65 ℃恒溫水浴搖床，150 r/min， 反應48 h。HPLC檢測酶轉化產物。

（4）pH對海藻糖制備的影響。用質量濃度為200 g/L馬鈴薯淀粉經液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普魯蘭酶5 U/g淀粉，pH 5.0、5.5、6.0 ，60 ℃恒溫水浴搖床，150 r/min， 反應48 h。HPLC檢測酶轉化產物。

（5）底物濃度對海藻糖制備的影響。用質量濃度為 100、150、200、250、300 g/L 馬鈴薯淀粉經液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普魯蘭酶5 U/g淀粉，pH 5.5，60℃恒溫水浴搖床，150 r/min，反應48 h。HPLC檢測酶轉化產物。

（6）環糊精葡萄糖基轉移酶（CGTase）對海藻糖制備的影響。用質量濃度為200 g/L馬鈴薯淀粉經液化，加入MTSase 80 U/g淀粉，MTHase 20 U/g淀粉，普魯蘭酶 5 U/g淀粉，分別在 0、12、24 h加入15 U/g淀粉的 CGTase和不加 CGTase，pH 5.5，60℃恒溫水浴搖床，150 r/min，反應48 h。HPLC檢測酶轉化產物。

1.2.7 酶轉化產物的檢測 用HPLC檢測酶轉化產物。 HPLC 檢測條件為：流動相（乙腈∶水=80∶20），流 速 ：0.8 mL/min， 柱 溫 40 ℃ ，NH2柱 （APS-2 HYPERSIL，Thermo Scientific），示差折光檢測器[23]。

2 結果與討論

2.1 目的基因的擴增

以 pET-24a（+）-treY 和 pET-24a（+）-treZ 為模板，擴增treY、treZ基因片段，PCR產物用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小分別約為2 200 bp和1 700 bp，與理論值一致。

2.2 重組表達質粒的構建

PCR擴增的treY、treZ基因片段分別與表達載體pSVN連接。連接產物轉化克隆宿主 E.coli JM109，LB固體培養基培養，挑取單菌落，經LB液體培養基培養8 h后，收集菌體抽提質粒，送測序公司測序，測序結果完全正確，重組表達質粒構建完成。重組表達質粒電轉化表達宿主Brevibacillus brevis構建重組菌。

2.3 重組菌的搖瓶發酵

重組菌經搖瓶30℃發酵，用高壓勻漿破碎菌體，上清液通過 15%分離膠進行 SDS-PAGE分析，結果如圖 1和圖2所示，在MTSase和MTHase理論分子量附近出現明顯的可溶性蛋白條帶。酶活測定結果顯示重組菌胞內酶活力分別達到MTSase 630.0 U/g（wet cell）、MTHase 170.0 U/g（wet cell），明顯高于 NakaDa等[3-4]報道的 MTSase 1.2 U/g（wet cell）和 MTHase 3.4 U/g（wet cell）。

圖1 重組MTSase蛋白電泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant MTSase

圖2 重組MTHase蛋白電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant MTHase

2.4 雙酶法制備海藻糖的條件優化

2.4.1 普魯蘭酶對海藻糖制備的影響 馬鈴薯淀粉含大量支鏈淀粉，然而MTHase和MTSase均不能作用于支鏈淀粉中的α-1，6-糖苷鍵，導致底物利用率降低。普魯蘭酶可水解α-1，6-糖苷鍵，從而產生包含α-1，4-糖苷鍵的直連多聚糖[24]。因此，本研究首先探究了添加普魯蘭酶復配對制備海藻糖的影響。結果如圖3所示，添加普魯蘭酶后海藻糖轉化率為74.2%，而不添加普魯蘭酶的海藻糖轉化率僅為46.4%，并且研究還發現在添加普魯蘭酶的一組中，除目的產物海藻糖、副產物葡萄糖和麥芽糖之外，麥芽三糖、四糖等其他組分比例較高，為38.6%，而添加普魯蘭酶時該組分含量明顯下降，僅為10.0%。因此，添加普魯蘭酶能夠有效改善底物利用率，從而提高海藻糖轉化率。

圖3 普魯蘭酶對海藻糖轉化率的影響Fig.3 Effects of pullulanase on the production of trehalose

2.4.2 加酶量、溫度、pH和底物濃度對海藻糖制備的影響 本研究對酶法制備海藻糖的條件進行了優化，主要優化MTSase和MTHase的加量、酶轉化的溫度、pH以及底物質量濃度。結果如圖4所示。

加酶量是影響酶反應產物產率的重要因素，并且還與成本有關。此外，由于MTSase和MTHase分別催化底物還原性末端的轉糖苷反應和麥芽寡糖基海藻糖的水解反應，兩者的使用比例對于產物組分組成具有重要影響。為了探究不同加酶量對海藻糖制備的影響，本研究在pH 5.5和55℃條件下考察了MTSase和MTHase不同的濃度和比例時的海藻糖轉化率。結果表明，當MTSase和MTHase的比例為4∶1，加酶量分別為80.0 U/g淀粉和20.0 U/g淀粉時海藻糖轉化率最高。

溫度也會影響酶轉化的結果，為了研究溫度對MTSase和MTHase雙酶法制備海藻糖的影響，本研究在4個不同溫度下進行酶轉化反應。當溫度分別為 50、55、60、65 ℃時， 海藻糖轉化率分別為：61.2%、74.4%、75.9%、65.1%。由數據可知，當在一定溫度范圍內，隨溫度的升高，海藻糖的轉化率也會相應提高，但是在達到最適溫度60℃后，海藻糖的轉化率隨溫度的升高而呈現下降趨勢。

不同的初始pH會對酶的活力及穩定性產生不同程度的影響，也會影響到酶轉化的效果，因此探究了不同初始pH對轉化率的影響。結果顯示當pH為5.5時，海藻糖對麥芽糊精的轉化率最高，能達76.0%。因此，酶轉化反應最適pH為5.5。

另外，底物質量濃度對酶轉化結果也有一定的影響，本研究考察了4種不同的底物質量濃度下海藻糖的轉化率。當底物質量濃度分別為100、150、200、250、300 g/L時，海藻糖轉化率分別為78.8%、78.6%、76.4%、74.2%、70.4%，隨著底物質量濃度的升高，海藻糖轉化率逐漸降低。

因此，海藻糖制備的最佳條件為：100 g/L馬鈴薯淀粉為底物，酶轉化溫度為60℃，pH為5.5，加酶量為MTSase 80 U/g淀粉、MTHase 20 U/g淀粉。

圖4 不同反應條件對海藻糖轉化率的影響Fig.4 Effects of different reaction conditions on the production of trehalose

2.4.3 CGTase對海藻糖制備的影響 從上述研究結果可以看出，反應產物中含有較多的葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖等小分子糖，研究表明，MTSase對DP值較高的麥芽寡糖或糊精等底物的親和力較高，而不能有效利用本研究中反應副產物小分子糖，造成底物浪費。CGTase是一種多功能糖基轉移酶，能催化糖分子之間的轉糖基作用，使此類小分子糖轉化生成糖鏈長度加長的產物[25]。由此推測CGTase能催化產物中無法利用的二糖以及三糖發生轉糖基反應生成MTSase酶反應底物，從而提高海藻糖的轉化率。因此，繼續探究了添加CGTase對海藻糖轉化率的影響，并考察了不同添加時間的酶轉化情況。如圖5所示，不加CGTase時，海藻糖轉化率為76.2%；反應初始加入CGTase時，海藻糖轉化率為80.2%；12 h和24 h時加入CGTase均下降，分別為78.7%和77.5%，說明添加CGTase能提高海藻糖產量，并且加入時間越早，轉化率提高越明顯。此外，與預期一致，反應產物中的麥芽糖及其他組分的含量均明顯下降，但葡萄糖的含量有所增加，這可能與CGTase的水解活性有關。

3 結 語

圖5 CGTase對海藻糖轉化率的影響Fig.5 Effects of CGTase on the production of trehalose

本研究首次將（Sulfolobus acidocaldarius）ATCC 33909來源的麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶在Brevibacillus brevis中進行了克隆表達，重組菌在TM培養基中發酵48 h，胞內酶活力分別達到 MTSase 630.0 U/g （wet cell）、MTHase 170.0 U/g（wet cell）。在此基礎上探究了雙酶法制備海藻糖的工藝。對重組MTSase和MTHase進行酶轉化實驗，結果表明，當以150 g/L馬鈴薯淀粉為底物，酶轉化溫度為 60℃，pH為 5.5，加酶量為MTSase 80 U/g淀粉、MTHase 20 U/g淀粉，普魯蘭酶5 U/g淀粉和環糊精葡萄糖基轉移酶（CGTase）15 U/g淀粉，反應48 h，海藻糖轉化率達到80.2%。