重組角質酶的制備及合成乙酸乙酯條件優化

郭小杰 ， 宿玲恰 ， 吳 敬 ， 陳 晟 *

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

角質酶（EC 3.1.1.74）是一種絲氨酸酯酶，屬于α/β水解酶家族中的最小成員[1]。研究表明，角質酶是一種多功能酶，不僅能夠水解角質的酯鍵，也能夠水解各種小分子可溶性酯類物質、短鏈和長鏈甘油三酯、聚己內酯和其他聚酯類物質[2-3]，此外，角質酶還能夠催化酯合成反應和酯交換反應[4-6]，因此在農業生產、天然產物提取、紡織、食品、洗滌劑、生物柴油及酯合成等領域具有廣泛的應用前景。

畢赤酵母表達系統是一種真核表達系統，已被成功應用于基礎研究和表達各種來源于人類、動物、植物、真菌、細菌和病毒等的重組異源蛋白[7-8]。該表達系統對異源蛋白表達有許多優勢：異源表達基因在甲醇誘導下整合到基因組中靠近乙醇氧化酶啟動子的下游，因此在甲醇作為唯一碳源的情況下可以實現目的基因的高效表達；異源蛋白也能在廉價原料的情況下實現大量分泌；畢赤酵母還能對異源蛋白進行翻譯后修飾，使其正確折疊和糖基化[9-11]。P.pastoris高密度發酵表達外源蛋白差異較大，一方面與外源基因本身的特性有關，另一方面發酵條件對其表達量也有重要影響，因此可以從培養基組成、溫度、pH、初始誘導菌濃、溶氧、誘導甲醇濃度等方面對發酵工藝條件進行優化研究。

乙酸乙酯（EA）又稱醋酸乙酯，為無色透明液體，是一種用途廣泛的精細化工產品，可用作涂料、人造革、人造纖維等的溶劑；也可用作黏合劑的溶劑，用于印刷油墨的生產；用做醫藥和有機酸等產品的萃取劑；還可用作紡織工業的清洗劑，也是制藥工業和有機合成中的重要原料；同時也是香料工業中的重要香料添加劑 ，為我國GB2760—86規定為允許使用的食用香料[12-13]。乙酸乙酯通常是通過從菠蘿、香蕉等果品中提取或者化學合成方法得到。前者得到的是混合酯類物質、濃度低、提取量少，從而使其生產成本比較高。而化學合成方法則是用強酸或者強堿作為催化劑在高溫高壓下反應生成，有副產物形成，且需要后處理[14-15]。與化學合成相比，酶催化合成反應具有區域選擇性和位置專一性、條件溫和、不會造成環境污染，且產品更易被大眾接受[16-17]。到目前為止，脂肪酶，酯酶和角質酶已經被廣泛用于在非水媒介中生產酯類物質[18-19]。

本研究對實驗室前期構建的含有酸性角質酶基因的重組畢赤酵母進行了3 L罐發酵工藝優化，并對其在有機溶劑中合成乙酸乙酯的工藝進行優化，以獲得高效合成乙酸乙酯的最優方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 含Sirococcus conigenus角質酶基因的重組菌P.pastoris KM71/pPIC9K-ScCutA為本實驗室保藏。

1.1.2 培養基 種子培養基（g/L）：酵母粉10，蛋白胨 20，YNB 13.4，甘油 30。

3 L 罐發酵培養基 （BSM）（g/L）：CaSO40.939，MgSO4·7H2O 14.9，KOH 4.13，K2SO418.2， 甘 油30，85%H3PO426.7 mL/L， 微量鹽溶液（PTM1）4.3 mL/L。

PTM1溶 液 （g/L）：CuSO4·5H2O 6，ZnCl220，Na2MoO3·2H2O 0.2，CoCl20.5，KI 0.08，MnSO4·H2O 3，H3BO30.02 ，FeSO4·7H2O 65 ，H2SO45.0 mL/L。

生長補料培養基 （g/L）：甘油500（含5 mL/L PTM1）。

甲醇誘導培養基：甲醇（含12 mL/L PTM1）。

1.1.3 試劑 硫磺脫氧膽酸鈉和對硝基苯丁酸酯（4-Nitrophenyl butyrate，pNPB）購于 Sigma 公司；酵母無氨基基礎氮源培養基（YNB）購自上海生工生物工程公司；分子級酵母粉和蛋白胨購自Oxoid（英國）公司；其他常規試劑均為國產分析純，購于國藥。

1.1.4 主要儀器 臺式高速離心機購自德國Eppendorf公司；超凈工作臺購自蘇州科盛有限制造公司；梅特勒DEL320pH計購自梅特勒-托利多儀器有限公司；721E型可見分光光度計購自上海光譜儀器有限公司；恒溫水浴搖床購自江蘇金壇億通電子有限公司；3 L Infors全自動發酵罐購自伊孚森生物技術有限公司；FC-2002型甲醇濃度檢測流加儀購自上海蘇波信息技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 P.Pastoris KM71/pPIC9K-ScCutA在3 L發酵罐的高密度發酵培養 從-80℃保藏的甘油管中以 0.2%的接種量將種子接種于種子培養基中，30℃、200 r/min培養20～24 h。采用3個階段的培養過程對畢赤酵母KM71/pPIC9K-ScCutA進行高密度發酵條件優化。首先，將種子液以體積分數10%的接種量接入含1 L基礎鹽培養基 （BSM）的3 L Infors全自動發酵罐中。發酵開始分批生長階段溫度控制在30℃，用氫氧化銨對pH值進行調整，并保持在5.0。通過偶聯轉速與溶氧，將溶氧水平維持在30%左右。當初始培養基中甘油耗盡后，開始溶氧反彈，隨著溶解氧的迅速增加，指數流加甘油來實現高細胞密度。在菌體量達到所需要的值時，停止流加甘油，饑餓處理1～2 h待培養基中甘油完全消耗掉后開始進行甲醇誘導。對誘導溫度、誘導階段甲醇維持體積分數和初始誘導細胞濃度的優化是通過改變誘導溫度（26、28、30℃）、初始誘導細胞濃度 OD600（50、100、150） 和誘導階段甲醇體積分數（0.25%、1%、2%）來實現。

1.2.2 角質酶酶活的測定方法 將 30 μL適當稀釋的酶液加入到 1 470 μL含50 mmol/L pNPB的1×Mcilvation緩沖液（pH 4.5）中，在340 nm處記錄對硝基酚的生成速率。酶活單位定義：在37℃，每分鐘水解對硝基苯丁酸酯生成1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位。

1.2.3 利用凍干角質酶制備短鏈芳香酯的反應條件優化

（1）重組Cutinase的純化和凍干。ScCutA用35%的硫酸銨沉淀、1×Mcilvation的緩沖液（pH 7.0）透析和DEAE-Sepharose陰離子交換柱進行純化，酶活最高的洗脫峰所對應的酶液用1×Mcilvation緩沖液（pH 4.5）透析、-80℃凝固，然后用真空冷凍凍干機過夜凍干。凍干的酶粉4℃保存用于酯合成反應。

（2）有機溶劑脫水。所有用于酯合成反應的有機試劑需要脫水預處理：將3?分子篩加入有機試劑中，室溫放置一個星期，濾去分子篩 ，得脫水有機溶劑。

（3）乙酸乙酯的酯合成方法。稱取一定量的乙酸和乙醇于20 mL帶塞燒瓶中，量取10 mL無水的有機溶劑（異辛烷、正己烷、正庚烷、丙酮、乙腈），加入50 U/mL的凍干角質酶粉，置于恒溫水浴搖床中，在搖床轉速150 r/min下反應一定時間，取樣待測。

（4）酸酯化率的定量分析。樣品在反應前后分別取500 μL加入到10 mL水中，以酚酞作指示劑，用0.005 mol/L的NaOH滴定，通過測定樣品在反應前、后酸值的降低值確定酯化反應產率，酯化率計算公式：轉化率（%）=1-消耗的NaOH體積/空白樣品消耗NaOH體積。

2 結果

2.1 3 L罐中高密度發酵生產角質酶

2.1.1 誘導溫度對重組菌生長以及產酶的影響溫度是影響菌體生長和外源蛋白表達的重要因素之一。升高溫度，有利于細胞的正常生長和蛋白表達，但溫度過高會使菌體過早衰老，而P.Pastoris的發酵周期相對較長，高溫會使其發酵周期縮短，降低外源蛋白的表達量，同時也會增加宿主細胞內蛋白酶的釋放，增加目的蛋白的降解[20]。因此，利用P.Pastoris表達外源重組蛋白的整個發酵過程中，菌體生長階段的培養溫度可以直接參照表達實驗手冊（Invitrogen公司）而定，而誘導產酶階段的溫度則需根據所表達的特定蛋白來定[21-22]。為考察溫度對ScCuA表達的影響，本研究在初始誘導細胞濃度OD600為50、誘導階段甲醇體積分數為0.25%條件下，考察了不同誘導溫度26、28、30℃對菌體生長和發酵產酶的影響。

由圖1（a）可知，在整個誘導培養過程中，28℃條件下更有利于菌體的生長，菌體生長要好于其他條件，至誘導138 h放罐時OD600達到286。但是從圖1（b）中可以發現，當誘導溫度為26℃和30℃時能夠達到的最高酶活相近，菌體在28℃誘導下所得酶活最高，為248.7 U/mL，為26℃和30℃誘導下的1.2倍。因此，發酵重組畢赤酵母生產角質酶時應采用28℃的誘導溫度。

2.1.2 誘導階段維持甲醇濃度對重組菌生長和產酶的影響 在酵母發酵過程中，甲醇不僅是整個誘導發酵過程中的唯一碳源，還是外源蛋白表達的誘導劑，它能誘導細胞產生大量的AOX酶，從而促進甲醇代謝為細胞生長提供能量及誘導目的蛋白表達。然而，并不是甲醇濃度越高越有利于外源蛋白的表達。在P.pastoris誘導表達外源蛋白的過程中，培養基中過高體積分數的甲醇會對酵母細胞產生毒害，抑制細胞代謝甲醇的功能[23]，導致細胞死亡率升高，進而降低目的蛋白的表達量[24]。因此，維持整個誘導發酵過程中的甲醇體積分數對細胞的生長和產酶有重要的影響。

本研究考察了當初始誘導細胞濃度OD600達到50，誘導溫度為28℃條件下，誘導階段維持不同體積分數的甲醇對P.pastoris菌體生長和角質酶產量的影響，最終確定誘導劑甲醇應該維持的最佳體積分數。如圖2（a）所示，在整個誘導培養過程中，1%甲醇體積分數條件下更有利于菌體的生長，菌體生長要好于0.25%和2%，且2%體積分數甲醇條件下，細胞生長明顯受到抑制，說明維持較高體積分數甲醇不利于細胞生長。對比不同甲醇體積分數下的酶活曲線，如圖3（b）所示，在誘導前72 h時，3個誘導甲醇體積分數下角質酶酶活相差不大。但是隨著誘導的進行，維持1%甲醇體積分數下增長迅速，發酵液中角質酶酶活最高，達到315.8 U/mL。因此，誘導階段維持1%的甲醇體積分數對角質酶在P.pastoris中的表達最有利。

圖1 誘導溫度對重組畢赤酵母細胞生長和產酶的影響Fig.1 Effects of inducing temperature on P.pastoris growth and production of cutinase synthase

2.1.3 初始誘導細胞濃度對重組菌生長和產酶的影響 利用重組畢赤酵母在3 L發酵罐的高密度發酵是許多重組蛋白工業化生產的重要途徑[25]。通常情況下，提高初始誘導菌體濃度可以增加誘導階段的生物量，使更多的甲醇合成外源蛋白[26]。然而當生物量達到較高水平時，培養條件（溶氧量、營養物質等）容易受到限制，外源蛋白的產量和穩定性也會受到影響，因此高表達量的獲得應以實際取得的生物量為準，高細胞濃度誘導下并不一定能得到高表達量[27]。為考察初始誘導菌體濃度對ScCuA表達的影響，本研究在初始誘導OD600為100、誘導階段甲醇體積分數為1%條件下，考察了不同初始誘導菌體濃度OD600分別為 50、100、150時對菌體生長和發酵產酶的影響。

圖2 維持不同甲醇體積分數對重組畢赤酵母細胞生長和產酶的影響Fig.2 Effects of methnol concentrations on P.pastoris growth and cutinase production

由圖3可知，在誘導前72 h，初始誘導菌體濃度對重組菌生長的影響較明顯，但是達到穩定期后菌體濃度差別不大。當初始誘導菌濃（OD600）由50增加到100時，最高酶活從 315.8 U/mL增加到419.2 U/mL。而當初始誘導菌濃為150時，酶活反而下降到363.5 U/mL。可能是由于菌體濃度過高時，罐內的營養物質和溶氧條件都較低菌濃條件下差，嚴重影響了菌體的生長和產酶。因此選擇OD600=100作為最適的初始誘導菌體濃度。

2.2 重組角質酶酯合成條件優化

2.2.1 不同有機溶劑對酸酯化率的影響 通常情況下，酶在有機相中的催化活性和穩定性與有機溶劑的疏水性有關，其活性隨著溶劑親水性的增大而減弱；同時不同有機溶劑對底物的溶解度也不同，只有溶解在溶劑中的底物才能參與酯化反應[28-29]。本實驗考察了反應溫度為40℃，加酶量50 U/mL，乙酸底物濃度0.1 mol/L，酸醇摩爾比為1∶1條件下，分別在異辛烷、正庚烷、正己烷、丙酮、乙腈中，對乙酸乙酯轉化率的影響。由圖4可知，在各種有機溶劑中角質酶催化合成乙酸乙酯的酯化率各不相同，使用乙腈和丙酮作溶劑時，酯化率均較低，分別只有43.16%和58.32%；用正庚烷、正己烷和異辛烷作溶劑時，乙酸的酯化率均高于75%，其中用異辛烷作溶劑時，反應16 h時酯化率最高，達到82.52%。因此選用異辛烷作為角質酶催化合成乙酸乙酯的溶劑。

圖3 初始誘導菌濃度對重組畢赤酵母細胞生長和產酶的影響Fig.3 Effects of initial induction cell density on P.pastoris growth and cutinase production

2.2.2 溫度對酸酯化率的影響 溫度對生物催化反應的活性、選擇性、穩定性，以及熱力學平衡有重要的影響[30]。本實驗研究了不同反應溫度30～80℃，在異辛烷10 mL，加酶量50 U/mL，酸底物濃度0.1 mol/L，酸醇摩爾比為1∶1條件下反應16 h，對乙酸乙酯轉化率的影響。如圖5所示，最適反應溫度為 30～55℃，且在 50℃反應達到最大轉化率85.57%。這一結果與該酶在水相中的水解性質不一致，一方面，可能是由于酶的結構在凍干過程中發生改變，使酶的穩定性增加。另一方面，固體酶比液體酶在有機溶劑中更穩定。然而，隨著溫度的繼續升高，轉化率呈降低趨勢。這可能是由于高溫使部分酶蛋白失活，因為高溫是蛋白質變性和失活的重要原因之一[31]。

圖4 不同有機溶劑對乙酸酯化率的影響Fig.4 Effects of different organic solvents on the esterification rate of acetic acid

圖5 溫度對乙酸酯化率的影響Fig.5 Effects of different reaction temperature on the esterification rate of acetic acid

2.2.3 底物濃度對酸酯化率的影響 眾所周知，從熱力學角度來講，增加底物濃度有利于加快反應速度、促進反應平衡向產物方向移動[14，32]；同時在酯合成反應中，也可以通過加入過量的親核試劑（醇）或者把產物從反應混合物中移除來推動反應平衡向產物生成方向移動[33-34]。然而，過量的醇又會降低反應速度。因此，考慮到生產成本和催化反應中存在的底物抑制現象，需要確定一個使乙酸乙酯轉化率達到最大值的最佳底物濃度。

（1）底物乙醇濃度對酸酯化率的影響。通過固定乙酸的濃度為0.1 mol/L，改變醇的濃度0.05～0.3 mol/L，研究醇濃度對酯合成轉化率的影響。如圖6所示，乙酸乙酯的最大轉化率在乙醇濃度為0.15 mol/L時達到最大值94.12%。然而，繼續增加乙醇濃度從0.15 mol/L到0.3 mol/L，乙酸乙酯的轉化率呈明顯的降低趨勢。一方面可能是由于過量的醇使反應體系中的部分酶失活[30]；另一方面可能是由于高濃度的醇改變了介質的極性，這與使用高極性試劑達到的效果是一致的[15，31]。因此乙醇的最佳濃度為0.15 mol/L。

圖6 乙醇濃度對乙酸酯化率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on the esteri fication rate of acetic acid

（2）底物乙酸濃度對酸酯化率的影響。為了研究乙酸濃度對酯合成轉化率的影響，通過固定乙醇的濃度為0.15 mol/L，改變乙酸的濃度0.05～0.3 mol/L。如圖7所示，隨著乙酸濃度的增加，乙酸的酯化率呈增加趨勢，當乙酸濃度為0.1 mol/L時，轉化率達到最大值94.12%，然而繼續增加乙酸濃度（0.1～0.3 mol/L），乙酸乙酯的轉化率呈明顯的降低趨勢。這可能是由于當乙酸濃度過高時，會影響角質酶的穩定性。因此選定0.1 mol/L為反應最佳乙酸濃度。

圖7 乙酸濃度對乙酸酯化率的影響Fig.7 Effects of acetic acid concentration on the esterification rate of acetic acid

3 討論

目前，國內外學者對角質酶的研究越來越多。關于角質酶在畢赤酵母中的高密度已經有不少文獻報道，Seman等人[9]將來源于Glomerella cingulata的角質酶基因在Pichia pastoris中進行補料分批發酵優化，誘導24 h時角質酶酶活達到434 U/mL；北京化工大學麻瑩等人[35]將Monilinia fructicola角質酶在畢赤酵母中進行異源表達時產量為 128.56 U/mL；Kwon等人[10]將角質酶在 P.pastoris中異源表達，未經發酵條件優化，不含His標簽的角質酶產量達到342 mg/L，表明以P.pastoris作為宿主菌制備角質酶具有很大的潛力。在上述研究的基礎上，本研究對重組畢赤酵母KM71/pPIC9K-ScCutA基因工程菌在3 L發酵罐進行了發酵工藝優化，發酵138 h時上清的最大酶活可達到419 U/mL，是優化前的2倍，并且是搖瓶的14.7倍左右。下一步研究重點是將該角質酶基因進行多種伴侶蛋白協同表達，如二硫鍵異構酶（PDI）和核糖體結合蛋白（BIP）可以幫組蛋白質折疊，N-乙酰轉移酶（Mpr1）能降低細胞氧氣消耗過程中的活性氧（ROS），以期獲得更高表達量的角質酶酶液。

乙酸乙酯作為一種無毒無害的綠色溶劑，其市場需求量隨著經濟的發展呈快速的增長趨勢。據統計，2014年世界乙酸乙酯總消費水平達到2 800 kt/a。酶法合成芳香酯因條件溫和、無污染而有希望替代化學合成法。徐巖等人[6]利用重組酶以0.5 mol/L的乙醇和0.5 mol/L的乙酸為底物時，35℃反應72 h，轉化率可高達91.5%；de Barros等人[36]研究 F.solani pisi角質酶在異辛烷中催化合成短鏈脂肪酸酯，其中乙酸乙酯的轉化率為78%。本研究考察了有機試劑種類、溫度、反應時間、底物酸濃度以及底物醇濃度等對合成乙酸乙酯的影響，其最大轉化率達到94.12%。雖然異辛烷作為反應溶劑可以得到高得率的乙酸乙酯，但是它易燃、易揮發、沸點高、有毒性等特點，限制了它的工業應用。在后續的研究工作中，可著重嘗試用離子液體或者微乳液代替異辛烷作為反應溶劑。

4 結語

本研究對重組畢赤酵母KM71/pPIC9K-ScCutA基因工程菌在3 L發酵罐進行了發酵工藝優化，發酵138 h時上清的最大酶活可達到419 U/mL，是優化前的2倍。對該重組角質酶在有機相合成乙酸乙酯的酯合成條件進行了優化。結果表明，最優條件為底物乙酸濃度為0.1 mol/L，乙醇濃度為0.15 mol/L，溫度50℃，在異辛烷中反應16 h，乙酸乙酯可以達到最大轉化率94.12%。