共表達N-乙酰轉移酶和磷脂酶重組菌的構建及發酵優化

吉得寧 ， 宿玲恰 ， 吳 敬 ， 吳 丹 *

（1．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2．江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

磷脂酶 （phospholipase，NCBI，EGU84973.1）是可以將磷脂水解為小分子脂肪酸、甘二酯和磷酸膽堿的一類酶的簡稱[1]。目前磷脂酶被應用在很多方面，例如制作面包、蛋黃[2]、植物油的精煉等方面，特別突出的是在油脂脫膠方面[3]。與傳統的物理脫膠方法相比，酶法脫膠可以大大減少化學品的消耗和幾乎不產生任何廢水，形成了一種經濟，高效，穩定的綠色油脫膠工藝。過去的幾十年中，由于磷脂酶具有的巨大商業價值，吸引了大量的研究。國內外關于磷脂酶制備的研究主要集中于磷脂酶基因在異源宿主系統進行表達，來源于米曲霉[4]、釀酒酵母[5]、粗糙脈孢菌[6]的磷脂酶基因，已經成功克隆表達。據報道，磷脂酶基因異源表達的宿主包括大腸桿菌[7]、米曲霉、釀酒酵母[4]、黑曲霉[8]等，主要通過發酵優化提高磷脂酶的表達水平。

來源于尖孢鐮刀菌的磷脂酶基因，目前并未有報道該基因在P.pastoris中克隆表達和優化，為了提高磷脂酶的表達量，本文選擇高表達量的畢赤酵母表達系統[9-10]。甲醇利用型巴斯德畢赤酵母具有高表達、高穩定、高分泌、容易放大、成本低等優點，同時可對表達的蛋白進行翻譯后的加工與修飾，已被廣泛用于表達多種蛋白[11]。近年來研究在重組畢赤酵母中，表達另外一種酶可以提高目標蛋白的表達量。在酵母、霉菌、植物等生物體中發現一種N-乙酰轉移酶（Mpr1）[12]。Mpr1是一類能催化乙酰基團在乙酰輔酶A和胺之間轉移的酶。Mpr1具有顯著的抗ROS氧化脅迫生理功能，增加溫度耐受度[13]，以及凍干耐受度[14]等，從而顯著提高細胞活性，提高磷脂酶在畢赤酵母中的表達量。

前期工作發現來源于尖孢鐮刀菌的磷脂酶基因，具有很好的穩定性和應用性，構建磷脂酶在畢赤酵母中克隆表達的重組菌。在前期工作的基礎上，為了進一步提高磷脂酶在畢赤酵母中的表達量，本研究構建了N-乙酰轉移酶在P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase中表達的重組畢赤酵母菌株，并探究其在3.6 L發酵罐中誘導表達磷脂酶的最佳條件，為工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重組P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase菌株和重組質粒pPICZA-Mpr1由本實驗室構建并保存。P.pastoris表達質粒pPICZA購于美國Invitrogen公司。

1.1.2 培養基 YPD培養基：10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。

BMMY培養基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素 4×10-4g/L，甲醇 40 g/L。

BMGY培養基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油 10 g/L，生物素 4×10-4g/L。

種子培養基：10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，YNB 13.4 g/L，甘油 30 g/L。

BSM培養基：85%磷酸 26.7 ml/L，二水硫酸鈣0.93 g/L，硫酸鉀 18.2 g/L。

七水硫酸鎂 14.9 g/L，氫氧化鉀 4.13 g/L，甘油30 g/L，PTM1 4.35 ml/L。

PTM1低鹽溶液：硫酸銅 6 g/L，碘化鉀 0.08 g/L，一水硫酸錳 3.0 g/L。

鉬酸鈉 0.2 g/L，硼酸 0.2 g/L，氯化鈷 0.5 g/L，氯化鋅 20.0 g/L，七水硫酸亞鐵65.0 g/L，生物素0.2 g/L，濃硫酸 5.0 ml/L。

補料生長培養基：質量濃度為500 g/L的甘油（含 12 ml/L PTM1）。

甲醇誘導培養基：100%甲醇 （含 12 ml/L PTM1）。

1.1.3 試劑 蛋白胨、酵母抽提物購自Oxiod，酵母無氨基基本氮源培養基（YNB）、遺傳霉素G418購自上海生工生物工程公司。其他均為國產分析純試劑。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺購自蘇州科盛有限制造公司；恒溫水浴搖床購自江蘇金壇億通電子有限公司；凝膠成像儀、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；3.6 L Infors全自動發酵罐購自伊孚森生物技術有限公司（中國）；FC-2002型甲醇濃度檢測流加儀購自上海蘇波信息技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-MPR1的構建與篩選 載體的線性化通過使用限制性內切酶Sac I進行，酶切體系（60 μL）如表 1 所示。

表1 酶切體系Table 1 Digested system

上述各組分充分混勻，37℃水浴約2 h，然后進行核酸瓊脂糖凝膠電泳驗證，凝膠成像儀下看目的片段，正確后膠回收。

（1）將 6 μL左右的線性化 DNA 加入 80 μL酵母感受態細胞混合，轉至提前預冷的2 mm電轉杯，設置電壓2 500 V，快速電擊，將電擊時間控制4～10 ms。

（2）結束后將1 mL 1 mol/L山梨醇（提前預冷）迅速與菌體充分混勻，然后將其轉移至1.5 mL無菌EP中，30℃、50 r/min溫浴約 2 h。

（3）將上述處理好的菌液均勻涂布在含質量濃度0.5 mg/mL遺傳霉素（G418）抗性MD平板上，于30℃恒溫條件下培養，直至長出單菌落。

（4）牙簽挑取MD平板上的菌落，點種到YPD平板（Zeocin抗性）上，分別將Zeocin質量濃度梯度設為 0.5，1，2 mg/mL。

（5）挑取Zeocin抗性質量濃度為2 mg/mL平板上的轉化子接種到YPD培養基 （10 mL）中，30℃，200 r/min培養24 h左右，進行表達驗證。

1.2.2 搖瓶發酵產磷脂酶 搖瓶發酵：從-80℃保藏的甘油管中以2%的接種量接種至YPD液體培養基，培養24 h。然后取2.5 mL轉接BMGY培養基，培養24 h，轉移至BMMY，加入甲醇于30℃進行誘導，誘導后120 h取樣測酶活，誘導120 h時，離心取得上清即為粗酶。

1.2.3 種子搖瓶培養 從甘油管中接200 μL菌液于100 mL發酵種子培養基中（100 mL培養基/500 mL三角瓶），于30℃、200 r/min培養24 h。

1.2.4 補料高密度共表達發酵 甘油分批發酵階段：將發酵種子培養基中菌液按10%接種量接入裝有900 mL BSM培養基的3.6 L全自動發酵罐中分批培養（以25%氨水控制pH 5.0，溫度30℃），調節攪拌轉速和通氣量維持溶氧在30%以上。

甘油補料分批培養階段：當甘油耗盡（約18 h）時溶氧（DO）迅速上升，此時通過溶氧反饋調節以16.3 mL/（L·h）的流速控制流加補料生長培養基。

甲醇誘導發酵階段：當菌體達到一定質量濃度后停止補料，并讓菌體饑餓約30～60 min，然后通過FC2002型甲醇監測流加控制器 （華東理工大學，上海）控制流加可維持恒定質量濃度的甲醇誘導培養基，誘導凝乳酶的表達。發酵控制過程由發酵罐控制系統軟件進行在線控制和數據采集。

1.2.5 菌體生物量的測定 采用比色法，將菌液稀釋到一定倍數后用Bio-photometer于波長600 nm處以去離子水為對照進行比色測定，以波長600 nm吸光度的數值在0.2～0.8之間為原則，OD600=OD讀數×稀釋倍數，確定OD600的數值。稱量干燥的5 mL離心管，取4 mL菌液放于其中，離心去上清，然后在105℃下烘干至恒重，稱量并計算菌體質量濃度。

1.2.6 蛋白含量的測定 重組P.pastoris發酵液中總蛋白含量的測定采用Bradford法，以牛血清蛋白為表樣制作標準曲線。

1.2.7 磷脂酶酶活測定方法 將200 μL適當稀釋的酶液加入到10 mL含有大豆卵磷脂的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 5.0）中，使大豆卵磷脂的終質量濃度為40 g/L。振蕩混勻后置55℃水浴鍋中反應5 min，加入終止劑95%的乙醇，振蕩，加入100 μL的酚酞，然后于自動滴定儀下用NaOH標準溶液滴定，觀察顏色，確定空白顏色變色臨界點為滴定的終點，將樣品與空白滴定后的顏色一致，計算標準堿液平均消耗量。磷脂酶酶活力定義為：在特定條件下 1 min水解磷脂產生1 μmol量游離脂肪酸所需的酶量即為一個磷脂酶活力單位（U）。

計算公式為其中，X為樣品的酶活力，U/mL；V為滴定樣品時消耗的NaOH標準溶液體積，mL；V0為滴定空白時消耗的 NaOH標準溶液體積，mL；c為NaOH標準溶液的濃度，mol/L，50～0.05 mol/L NaOH 標準溶液1.0 mL相當于脂肪酸50 μmol；n為酶液樣品的稀釋倍數；t為測定酶活時的反應時間。

2 結果和討論

2.1 重組菌P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的構建和搖瓶發酵

2.1.1 重組菌株 P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的構建和篩選 將前期工作構建好的重組質粒pPICZA-Mpr1（圖1），用Sac I線性化[15]，然后電轉至 P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase感受態細胞，由于在P.pastoris染色體中已經有pPIC9K-phospholipase（圖2），其攜帶有G418抗性基因，可直接涂布G418抗性質量濃度為0.5 mg/mL MD平板[16]。挑取抗性MD板上長出的重組轉化子，點接到Zeocin抗性質量濃度分別為0.5、1、2 mg/mL的抗性YPD平板中。表達載體pPICZA有Zeocin抗性，可以通過篩選重組菌抗Zeocin的能力來獲得高拷貝數目的基因轉化子，最后在2 mg/mL Zeocin抗性質量濃度的YPD平板上挑選出轉化子。

2.1.2 重組菌株 P.pastorisKM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1的搖瓶產酶 將篩選出來的重組畢赤酵母菌株搖瓶發酵，誘導120 h后表達磷脂酶胞外酶活達到最大值為850 U/mL，是前期磷脂酶單獨表達胞外上清酶活的1.3倍。重組菌株表達的磷脂酶的SDS-PAGE電泳（圖3）顯示，在30 kDa處有目的蛋白條帶，與理論的磷脂酶分子量相符合。綜上所述：Mpr1在P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase中的表達可以提高磷脂酶的表達量。

圖1pPICZA-Mpr1重組質粒圖譜Fig.1 pPICZA-Mpr1 recombinant plasmid map

圖2 pPIC9K-phospholipase重組質粒圖譜Fig.2 pPIC9K-phospholipase recombinant plasmid map

2.2 3.6 L發酵罐中高密度發酵生產磷脂酶

圖3 Mpr1和磷脂酶重組菌胞外上清液聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of the extracellular supernatant in the recombinant strain

2.2.1 不同的誘導溫度對菌體生長及產磷脂酶的影響 P.pastoris高密度發酵是工業化生產外源重組蛋白的一個重要途徑。溫度是影響菌體生長和目的蛋白表達的很重要的因素[17-18]。升高溫度，有利于菌體的生長，過高的溫度將會影響菌體正常的生長和目的蛋白的表達。本次實驗研究了在3.6 L發酵罐中菌體質量濃度為40 g/L開始誘導，誘導甲醇體積分數為1.0%，誘導溫度分別為28，30，32℃三個條件，進行誘導溫度的優化。

如圖4所示，當誘導溫度為28、30℃時，菌體的生長是隨著時間的增加而逐漸遞增的，在誘導110 h后菌體濃度趨于穩定，分別為201、199 g/L。當誘導溫度為32℃時，誘導0～90 h菌體的生物量隨著誘導時間的增加而增加，但是當誘導時間在90～120 h時，發酵后期菌體的濃度開始逐漸降低，最后誘導120 h的菌體生物量為182 g/L。當誘導溫度超過30℃，可能由于溫度過高，影響菌體的生長，菌體開始裂解，所以應將誘導溫度控制在30℃以下。

如圖5所示，磷脂酶的表達量隨著誘導溫度的降低，表達量越高。誘導溫度從28℃增加到30℃時，誘導120 h后，磷脂酶的酶活由8 100 U/mL降為6 050 U/mL。當誘導溫度從30℃增加到32℃時，磷脂酶的酶活由6 050 U/mL降為5 100 U/mL。當誘導溫度為28℃時，誘導120 h的蛋白表達量分別為8.3 mg/mL，分別是誘導溫度為 30、32℃的1.32、1.56倍。由此得知，誘導溫度越低，酶的蛋白表達量越高。較低的溫度誘導，可以穩定細胞膜和更加有效地降低蛋白酶的水解率，從而提高酶的表達量[19]。工業生產上誘導溫度低于28℃，具有生產成本高、制冷設備的承受能力要求高和工藝的可放大性可能性小的缺點，所以重組菌最優的發酵條件為28℃。

圖4 不同誘導溫度菌體生長的影響Fig.4 Effect of different temperatures on cell growth during the induction phase

圖5 不同誘導溫度對磷脂酶表達的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the phospholipase expression during the induction phase

2.2.2 不同的初始誘導生物量對菌體生長及產磷脂酶的影響 不同的初始誘導菌體質量濃度對于產酶的影響是很關鍵的[20]。通常情況下外源蛋白的最終表達量與初始誘導菌體質量濃度成正比，菌體質量濃度越高，蛋白的表達量就越高[21]，但是當生物量達到過高水平時，培養條件容易受到制約，外源蛋白的產量和穩定性也會受到影響。為考察初始菌體質量濃度對菌體生長和產磷脂酶的影響，本研究在3.6 L罐中初始發酵培養基中的甘油耗盡，開始指數流加不同體積的甘油，至菌體質量濃度分別達到20、40、60 g/L三個不同菌質量濃度時開始誘導；誘導階段通過甲醇電極維持1.0%的甲醇體積分數，誘導溫度28℃，誘導120 h后，觀察菌體生長和發酵產酶的情況。

由圖6可知，在誘導前100 h，初始誘導菌體質量濃度對菌體生長的影響較明顯，但是達到穩定期后菌體質量濃度基本保持穩定。在初始誘導菌體生物量為60 g/L時，誘導120 h后生物量達到最高，同時結合圖7可知，當初始誘導菌質量濃度由20 g/L增加到40 g/L時，誘導120 h后磷脂酶酶活由6 230 U/mL增加到8 100 U/mL，當初始誘導菌質量濃度從40 g/L增加到60 g/L時，磷脂酶酶活則由8 100 U/mL下降到7 250 U/mL，因此初始誘導菌質量濃度為40 g/L時磷脂酶的表達量最高，最終細胞質量濃度維持在201 g/L左右，此時磷脂酶的生長情況和產酶情況最優。本次研究Mpr1和磷脂酶在P.pastoris中共表達中發現，磷脂酶的表達量并不是一直和初始誘導菌質量濃度成正比，而是在合適的生物量時誘導能較明顯地提高重組酶表達量，這樣既能維持細胞平穩生長，又能提高磷脂酶的表達量。因此本實驗最優的初始誘導生物量為40 g/L。

圖6 不同起始誘導菌體質量濃度對菌體生長的影響Fig.6 Effect of different initial induction cell density on cellgrowth and the phospholipaseexpression during the induction phase

圖7 不同起始誘導菌體質量濃度對磷脂酶表達的影響Fig.7 Effect of different initial induction cell density on the phospholipase expression during the induction phase

2.2.3 不同的甲醇誘導體積分數對菌體生長及產磷脂酶的影響 P.pastoris表達外源蛋白的過程中，誘導階段甲醇體積分數不僅會影響細胞生長，與外源蛋白的表達產量也存在很大關系。甲醇作為誘導階段唯一碳源和誘導劑，通過誘導細胞產生甲醇代謝所需醇氧化酶后消耗甲醇為細胞生長產酶提供能量，同時誘導外源蛋白表達，但在代謝甲醇過程中產生的甲醛和，等小分子過氧化物會對細胞產生毒害作用，因此如何控制合適的甲醇體積分數是高密度誘導發酵關鍵因素之一。本次研究中，初始誘導菌體質量濃度控制在40 g/L、誘導溫度為28℃，探究了不同甲醇體積分數對菌體生長及產磷脂酶的影響。

菌體的生長情況如圖8所示，甲醇體積分數維持分別在0.5%、1.0%、1.5%，誘導120 h后菌體質量濃度分別為199、200、195 g/L。菌體質量濃度大體一致，但是從整個誘導過程中可以看出甲醇體積分數為0.5%、1.0%比1.5%生長得好，說明在1.5%體積分數甲醇條件下，細胞生長受到抑制，維持較高體積分數甲醇不利于細胞生長。

圖9顯示不同甲醇體積分數下細胞產酶水平變化，甲醇誘導體積分數為1.0%時，磷脂酶的酶活單位是甲醇誘導體積分數分別為0.5%、1.5%的1.14、1.3倍。誘導甲醇體積分數為0.5%的蛋白表達量高于甲醇體積分數為1.5%，所以過高的甲醇體積分數不利于酶的表達。在適合的甲醇體積分數條件下，磷脂酶的酶活和蛋白表達量達到最高。但是較高的甲醇體積分數可能會產生毒素，影響細胞中的代謝途徑，導致酶的表達量降低[22]。所以重組菌發酵產生磷脂酶最優的甲醇誘導體積分數為1.0%。

圖8 不同體積分數甲醇誘導對菌體生長的影響Fig.8 Effect of different methanol concentration on cell growth during the induction phase

圖9 不同體積分數甲醇誘導對磷脂酶表達的影響Fig.9 Effect of different methanol concentration on the phospholipaseexpression during theinduction phase

3 結 語

本研究中構建重組菌株P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1和重組菌在3.6 L發酵罐中發酵工藝進行優化。搖瓶發酵初步研究得到胞外上清酶活850 U/mL，是前期磷脂酶單獨表達的1.3倍。重組P.pastoris KM71/pPIC9K-phospholipase/pPICZA-Mpr1菌株進行最佳發酵條件的探究，通過考察不同的誘導溫度、起始誘導生物量和甲醇誘導體積分數，確定其最佳發酵條件。結果表明，在溫度為28℃，初始誘導菌體質量濃度為40 g/L，1.0%甲醇誘導體積分數時高密度發酵得到發酵上清的最大酶活可達到8 100 U/mL。這為后續磷脂酶進一步工業化生產奠定了基礎。