sucA缺失型大腸桿菌菌株的構建與發酵條件優化

林 凡 ， 張震宇 ， 孫付保 *， 于 林

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

反式-4-羥脯氨酸屬于不常見的氨基酸，其在醫藥、美容、化工、食品等領域均具有重要作用[1-3]，故近年來對其研究愈發增多。羥脯氨酸最初是在特定的蛋白中發現的，如膠原蛋白、肽類抗生素（放線菌素、綠灰菌素）[4]，目前主要是從動物膠原蛋白中分離提取獲得[5]，但由于該方法需要復雜的純化過程并會產生大量的廢棄物[6]，所以研究酶轉化生產羥脯氨酸具有現實必要性。

putA編碼的PutA蛋白具有脯氨酸脫氫酶和吡咯啉-5-羧酸脫氫酶雙重功能，在E.coli細胞中，該蛋白可以催化脯氨酸氧化生成谷氨酸，使得細胞內的脯氨酸積累量減少，不利于羥脯氨酸的生成。敲除putA基因可以有效提高由脯氨酸向羥脯氨酸的轉化率[7]。在TCA循環中，α-酮戊二酸脫氫酶催化α-酮戊二酸到琥珀酸的過程[8-9]，sucA基因編碼的是α-酮戊二酸脫氫酶復合體的E1亞基，敲除該基因可以使α-酮戊二酸脫氫酶活性喪失[10]。而來自于指孢囊菌并已進行密碼子優化的反式-4-羥化酶基因（hyp）編碼的酶可以將游離的L-脯氨酸轉化為反式-4-羥脯氨酸[1，6]，同時將α-酮戊二酸轉化為琥珀酸。利用此特點，以羥化酶基因取代sucA基因，使得菌株在生長的同時可以積累反式-4-羥脯氨酸。在此過程中，反式-4-羥脯氨酸的積累與細胞的生長相互偶聯。此外，編碼透明顫菌血紅蛋白（VHb）的vgb基因可以通過提高氧氣的傳遞而增強呼吸作用和能量代謝[11-12]，故在質粒上引入該基因對于長時間的發酵過程較為有利。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 E.coli BL21（DE3）ΔputA為本實驗室前期構建，E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）為本實驗室保存；表達載體pUC19-ptrp2-hyp-vgb（簡稱pUHVT4）為實驗室之前構建的，質粒pET21a、pKD4為本實驗室所有，質粒pKD46由他人惠贈，T載（pUCm-T）購自上海生工。

1.1.2 試劑與酶 實驗中涉及的限制性內切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker購自Takara（大連寶生物），Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶購自上海生工。膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、胰蛋白胨和酵母提取物購自上海生工。其他的生化試劑購自國藥。

1.1.3 引物 引物H1和H2用于合成sucA基因的上游同源臂，P1和P2用于合成卡那抗性基因（kan），引物H3和H4用于合成sucA基因的下游同源臂，同源臂選用長同源臂，引物設計參考文獻[13]。其中，引物 H1的 5′端帶有 Nde I酶切位點，H4的5′端帶有Xho I酶切位點，用于基因片段與載體的連接；引物H2帶有Hind III和BamH I酶切位點，用于羥化酶基因的插入；引物H2和P1、P2和H3反向互補，用于基因片段的融合。上述引物均由上海生工合成。

表1 研究中用到的引物Table 1 Primers used in the research

1.2 方法

1.2.1 含有打靶片段載體的構建 擴增獲得sucA基因的上、下游同源臂和卡那抗性基因，將三者以摩爾比1∶1∶1進行混合，以H1和H4為引物，擴增獲得3個基因片段的融合片段[14-15]。將融合片段與T載（pUCm-T）以 7∶1～10∶1 的比例混合，用 T4 DNA連接酶進行連接后導入E.coli JM109，載體命名為pUCm-T-AK，連接體系和條件參照Takara說明書。之后用Xho I和Nde I雙酶切載體pUCm-T-AK獲得含有酶切位點的融合片段，與同樣雙酶切的pET21a進行連接，載體命名為pET21a-AK。Hind III和BamH I雙酶切質粒pUHVT4獲得hyp基因，與同樣雙酶切的質粒pET21a-AK進行連接，載體命名為pET21a-AKH，從而獲得含有打靶片段的載體。

1.2.2 sucA基因敲除菌的獲得 本次基因敲除是基于Red重組系統進行的，具體實施步驟參考文獻[16-18]。

1.2.3 發酵液中羥脯氨酸的測定 采用比色法測定發酵液中的羥脯氨酸含量，反應原理與具體實驗步驟參考文獻[19]。

1.2.4 初步篩選高產菌株 將質粒pUHVT4轉入E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA 的轉化子中，35 ℃，220 r/min進行發酵 ，比色法測定羥脯氨酸的產量，將最為高產的菌株作為后續實驗的研究對象。提取該菌株的基因組，以Y1和H4為引物，PCR獲得打靶片段所在的基因片段，并測序。

1.2.5 全細胞酶活測定 在平板上劃線后，挑取單菌落接種LB液體培養基，37℃培養12 h，測定菌的全細胞酶活，測定方法參考[1，4]。其中，1個單位酶活的定義為：1 min催化反應得到1 μmol反式-4-羥脯氨酸的酶量，單位為U；全細胞酶活為每g干菌體的酶活，單位為U/DCW。

1.2.6 重組菌株發酵條件的優化 種子培養：挑取活 化 后 的 E.coliBL21 （DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）單菌落接種到含有抗生素的30 mL（250 mL錐形瓶）LB培養基中，37℃，220 r/min培養8 h。發酵培養：將種子液以6%的接種量接入30 mL（250 mL錐形瓶）發酵培養基中，35℃，220 r/min培養12 h。在搖瓶水平優化發酵培養基的組分與發酵條件下，確定較優的培養基組分。 包括葡萄糖（0、2、4、8、12、16 g/L）和甘油（0、3、6、10、14 g/L）、玉米漿（8、12、16、20、24 g/L）、K2HPO4（1.5、9、11、14、17、25 g/L）、（NH4）2SO4（0、3、8、13、17、21 g/L）和 FeSO4濃度 （0、1、2、3、4 mmol/L） 以及 pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），之后進行正交實驗。

2 結果

2.1 sucA基因的上、下游同源臂、卡那抗性基因以及融合片段的獲得

以提取的E.coli BL21（DE3）的基因組為模板，以H1、H2和H3、H4為引物，PCR獲得sucA基因的548 bp的上游同源臂和591 bp的下游同源臂。以質粒pKD4為模板，以P1和P2為引物，獲得大小為1 521 bp的kan基因片段（圖1）。三者混合，PCR獲得大小為2.6 kb的片段。

圖1 基因敲除用PCR片段的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis maps of PCR products for gene deletion

2.2 含有打靶片段的載體構建

重組質粒pUCm-T-AK，用引物H1和H4作為驗證引物，以提取的質粒為模板，PCR獲得大小為2.6 kb的條帶為正確質粒。質粒pET21a-AK用Hind III單酶切獲得大小為8 049 bp的條帶，Xho I和Hind III得到大小分別為2 093 bp和5 956 bp的兩條條帶，凝膠電泳圖譜見圖2。

2.3 E.coli△putA菌株的sucA基因敲除

以提取的質粒pET21a-AKH為模板，以H1和H4為引物，獲得大小為3.4 kb的打靶片段。電轉后的轉化子以引物Y1和P2作為驗證引物，在NCBI里將該引物與E.coli BL21（DE3）的基因組比對后沒有條帶，缺失菌經菌落PCR擴增則獲得大小為3 kb的電泳條帶。驗證正確的 E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（BPAP）轉化子有 4個，分別導入質粒pUHVT4。初始脯氨酸濃度為8 mmol/L，發酵12 h的發酵結果如圖3所示，選用羥脯氨酸產量最高的3號菌株作為后續的實驗對象。提取3號菌株的基因組，以Y1和H4為引物進行PCR，將獲得的PCR片段進行測序，測序結果表明，羥化酶基因成功重組到基因組上。

圖2 pET21a-AK單、雙酶切Fig.2 Double digests of pET21a-AK

圖3 4個轉化子的發酵結果Fig.3 Fermentation results of converters

2.4 各種菌株的全細胞酶活測定

測定 E.coli BL21 （DE3）、E.coli BL21（DE3）（pUHVT4）、E.coli BL21（DE3）ΔputA（pUHVT4）、E.coli （DE3）ΔsucA （pUHVT4）、E.coli BL21 （DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）五株菌株的全細胞酶活，結果見圖4。從測定結果看，菌株E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）的全細胞酶活最高，其次是E.coli BL21（DE3）ΔsucA（pUHVT4）和 E.coli BL21（DE3）ΔputA （pUHVT4）， 均高于原菌 E.coli BL21（DE3）（pUHVT4），說明不論單基因敲除還是雙基因敲除均有利于提高細胞的全細胞酶活。其次，E.coli BL21（DE3）ΔsucA（pUHVT4）的全細胞酶活高于菌 E.coli BL21（DE3）ΔputA（pUHVT4），說明從全細胞酶活來看，敲除基因sucA后的產羥脯氨酸的效果要好于敲除基因putA。而菌株E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）的全細胞酶活高于任何一個單敲除菌，說明兩個基因的敲除效果是相互疊加的卻又不是簡單的相加效果。

圖4 不同菌株的全細胞酶活Fig.4 Whole cell activity of strains

2.5 發酵單因素優化

2.5.1 碳源對反式-4-羥脯氨酸產量的影響 在不加甘油的前提下，對葡萄糖的質量濃度進行優化。從圖5來看，不加葡萄糖時，OD600與羥脯氨酸的產量遠低于其他濃度，但是羥脯氨酸的產量也在160 mg/L左右，分析原因可能是：發酵用的玉米漿中含有還原糖，可以為微生物提供少量的碳源。葡萄糖質量濃度為2 g/L時的OD600遠高于不加葡萄糖，但在高于2 g/L之后便沒有明顯的變化，而羥脯氨酸的產量則在葡萄糖質量濃度為4g/L時達到了最高值。在葡萄糖添加質量濃度為4 g/L的條件下，優化甘油的濃度。從圖6來看，甘油質量濃度對OD600沒有明顯的影響，而羥脯氨酸的產量則在甘油質量濃度為6 g/L時達到了最大值。

2.5.2 氮源對反式-4-羥脯氨酸產量的影響 玉米漿中富含多肽、多糖、亞硫酸、蛋白質以及多種氨基酸，這些成分多作為發酵生產氨基酸的前提物質。在發酵生產過程中除了作為氮源，玉米漿中的生長因子尤其是生物素對氨基酸的生產也有促進作用，故以玉米漿作為發酵有機氮源，成本低廉并且有效[20]。從圖7來看，玉米漿的添加有利于菌體的生長，在低于20 g/L時有利于羥脯氨酸的生成，但添加量高于20 g/L時，羥脯氨酸的產量不但沒有提高，反而有所下降。最終優化后，將最適的玉米漿質量濃度定為20 g/L。

圖5 葡萄糖對反式-4-羥脯氨酸產量的影響Fig.5 Effect of glucose on trans-4-hydroxyproline

圖6 甘油對反式-4-羥脯氨酸產量的影響Fig.6 Effect of glycerol on trans-4-hydroxyproline

圖7 玉米漿對反式-4-羥脯氨酸產量的影響Fig.7 Effectofcorn steep liquor on trans-4-hydroxyproline

2.5.3 K2HPO4對反式-4-羥脯氨酸產量的影響對K2HPO4的質量濃度進行優化，發現其對羥脯氨酸產量的影響最為顯著。從圖8來看，在K2HPO4的質量濃度低于17 g/L時，OD600隨著K2HPO4的添加逐漸升高，當質量濃度高于17 g/L時，OD600有所下降。而羥脯氨酸的產量在質量濃度為11 g/L時達到了最高值，由初始培養基的216 mg/L達到了753 mg/L。分析原因：K2HPO4為微生物的生長與氨基酸的發酵提供磷、鉀元素；同時，K2HPO4水溶液呈微堿性，可以與酸性物質反應生成KH2PO4，KH2PO4則與堿性物質反應生成 K2HPO4，K2HPO4與KH2PO4的酸堿性均不強，可以將發酵體系的pH維持在較為穩定的范圍。

圖8 K2HPO4對反式-4-羥脯氨酸產量的影響Fig.8 Effect of K2HPO4on trans-4-hydroxyproline

2.5.4 （NH4）2SO4對反式-4-羥脯氨酸產量的影響發酵過程中，（NH4）2SO4既可以作為無機氮源，同時NH4+是一種較好的緩沖離子，在某種程度上可以調節pH。其質量濃度對羥脯氨酸產量的影響如圖9所示，在（NH4）2SO4質量濃度低于 17 g/L 時，OD600隨著 （NH4）2SO4的添加而升高，當添加質量濃度高于17 g/L時，OD600開始下降。而羥脯氨酸的產量則在（NH4）2SO4質量濃度為13 g/L時達到了最高值。

圖9 （NH4）2SO4對反式-4-羥脯氨酸產量的影響Fig.9 Effect of（NH4）2SO4on trans-4-hydroxyproline

2.5.5 FeSO4對反式-4-羥脯氨酸產量的影響 脯氨酸羥基化生成羥脯氨酸的過程是由反式-4-羥化酶催化的，而反式-4-羥化酶屬于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族，該酶的催化過程需要Fe2+的參與[6]。從圖10來看，OD600隨著FeSO4濃度的升高而升高，也就是說，適量的添加亞鐵離子有利于菌體的生長。當不添加FeSO4時，仍有較高的羥脯氨酸產量，可能是由于玉米漿中含有一定濃度的鐵元素。最終優化結果表明，羥脯氨酸的產量在FeSO4濃度為1 mmol/L時達到了最高值。

圖10 FeSO4對反式-4-羥脯氨酸產量的影響Fig.10 Effect of FeSO4on trans-4-hydroxyproline

3.5.6 pH對反式-4-羥脯氨酸產量的影響 發酵培養液的初始pH會直接影響菌株的生長與代謝活動[21]，隨著發酵過程的進行，培養基成分的改變和微生物的代謝產物都會使pH發生極大變化。從圖11來看，隨著初始pH的增大，菌體OD600有所升高，但當pH到9.5時，菌體的生長受到極大的抑制，幾乎不能夠進行生長。而羥脯氨酸的積累量隨著pH的增大而逐漸升高，在pH為8.5時達到了最大值，之后迅速下降。表明，過堿的環境會嚴重抑制菌的生長與羥脯氨酸的產生。

圖11 pH對反式-4-羥脯氨酸產量的影響Fig.11 Effect of pH on trans-4-hydroxyproline

3.5.7 正交實驗 根據單因素優化的結果，進行正交實驗，正交因素和水平以及正交結果分別如表2和表3所示。

表2 正交實驗因素水平Table 2 Factors level of orthogonal experiment

表3 正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

由表中的極差得到因素的主次順序依次為：（NH4）2SO4（E）＞玉米漿（C）＞Fe2+（G）＞葡萄糖（A）＞甘油（B）＞K2HPO4（D）＞NaCl（F），得到的最佳組合：A2B3C1D2E1F1G2，即葡萄糖 4 g/L，甘油 10 g/L，玉米漿16 g/L，K2HPO411 g/L，（NH4）2SO4 8 g/L，NaCl 0.75 g/L，MgSO40.3 g/L，CaCl20.005 g/L，FeSO41 mmol/L。優化后的發酵培養基驗證：同樣培養條件下，培養基優化前的反式-4-羥脯氨酸產量為0.28 g/L，培養基優化后的反式-4-羥脯氨酸產量為1.08 g/L，是優化前的3.87倍。

3 結 語

本文在 E.coli BL21（DE3）ΔputA 的基礎上，進一步敲除了基因sucA并在基因組上引入羥化酶基因（hyp）。但由于基因組上的表達量不夠高，故導入輔助質粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb，其中，vgb基因能夠提高細胞的溶氧，對于長時間的發酵過程較為有利。實驗室前期進行菌株 E.coli BL21（DE3）（pUHVT4）的培養基優化，在初始脯氨酸400 mmol/L，發酵24 h后的反式-4-羥脯氨酸產量為0.97 g/L。而構建的突變菌優化發酵培養基后，在初始L-脯氨酸為100 mmol/L，發酵12 h時的產量為1.08 g/L，相比較而言，雙敲除菌 E.coli BL21（DE3）ΔputAΔsucA（pUHVT4）具有明顯優勢，不僅縮短了發酵時間，而且提高了脯氨酸的轉化率。

接下來需在搖瓶優化的基礎上，進行發酵罐的放大實驗，通過流加葡萄糖，維持重組大腸桿菌的持續生長從而不斷積累反式-4-羥脯氨酸，為工業化生產做準備。