Ni2+螯合的瓊脂糖凝膠載體用于重組酶SUMO-Hep I-His的固定化

張軒月， 程詠梅， 宋志新， 張 華， 陳敬華*

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.無錫貝迪生物工程股份有限公司，江蘇 無錫214092；3.常州生化藥業(yè)（江蘇）有限公司，江蘇 常州213000）

肝素酶（Heparanase，Hep）是一類多糖裂解酶，作用于肝素或者硫酸乙酰肝素的多糖裂解酶，目前主要應(yīng)用的有 Hep I、II、III[1]。 其中，Hep I是目前研究最為廣泛的肝素酶，利用Hep I的降解作用可以有效闡明肝素的結(jié)構(gòu)[2-3]、清除體外循環(huán)血液中多余的肝素[4]及制備低分子量肝素（low molecular weight heparins，LMWHs）[5-6]。 然而，從原始的肝素黃桿菌中得到的Hep I不穩(wěn)定且產(chǎn)量低，在30℃下的半衰期只有10 min，經(jīng)過一次凍融之后酶活只剩下45%[7]。酶活損失巨大，嚴(yán)重影響了Hep I的工業(yè)化應(yīng)用，因此現(xiàn)階段對(duì)Hep I的研究主要集中于提高其穩(wěn)定性和產(chǎn)量。Shpigel等人成功地在大腸桿菌中表達(dá)以纖維素結(jié)合蛋白 （CBD）為標(biāo)簽的CBD-Hep I重組酶，并且將CBD-Hep I固定在纖維素微球上后應(yīng)用于LMWHs的生產(chǎn)中，但CBD-Hep I在大腸桿菌中是以包涵體形式表達(dá)的，需要復(fù)性才能進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)固定化[8]；清華大學(xué)的邢新會(huì)教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建表達(dá)了MBP-Hep I融合酶，酶活達(dá)到20 650 IU/L，并通過麥芽糖與MBP標(biāo)簽的親和吸附將MBP-Hep I固定在Fe3O4@SiO2-PEO-maltose上，通過磁性微球有效分離產(chǎn)物與酶[9-11]；本研究室前期構(gòu)建了GST-Hep I融合酶，在大腸桿菌中表達(dá)酶活達(dá)到16 970 IU/L[12]。

近期，本研究室將助溶的SUMO標(biāo)簽蛋白基因片段與Hep I基因片段通過重疊PCR方法構(gòu)建重組pET-30a-SUMO-Hep I-His表達(dá)載體，將SUMO蛋白與肝素酶I N-端融合表達(dá)，優(yōu)化發(fā)酵得到高產(chǎn)量的融合肝素酶I，發(fā)酵產(chǎn)物酶活達(dá)到27 860 IU/L，游離酶在30℃的半衰期提高到1 h。該融合酶顯現(xiàn)出較大的工業(yè)化應(yīng)用潛能。

酶的固定化在工業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛，相比于游離酶，它能夠保證酶的穩(wěn)定性、產(chǎn)物與酶的快速分離以及酶的重復(fù)利用性[13-14]。因此本研究擬對(duì)融合酶SUMO-Hep I-His的進(jìn)一步固定化進(jìn)行研究。固定化材料GLK-Gel Ni是以瓊脂糖凝膠為載體，亞氨基二乙酸（IDA）為配基，并螯合金屬離子Ni2+而形成的一種親和層析介質(zhì)，它利用Ni2+螯合配體與蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基團(tuán)緊密結(jié)合達(dá)到蛋白質(zhì)的分離純化，具有吸附量大、分辨率高、選擇性好、成本低、易于再生等優(yōu)點(diǎn)。本研究將SUMOHep I-His固定于該載體上，達(dá)到一步式分離純化與固定化的效果，并對(duì)其固定化的條件、固定化效果以及固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肝素酶Sumo-Hep I-His質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；GLK-Gel Ni由無錫市加萊克色譜公司贈(zèng)送；大分子肝素鈉、牛血清白蛋白（BSA）、卡那霉素、考馬斯亮藍(lán)G-250、乙酸鈉、乙酸鈣等試劑均購自生工生物工程（上海）有限公司。

電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；超級(jí)恒溫水浴槽：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀：寧波新枝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)CR-22G II：日本日立儀器有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：島津有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝素酶的提取 將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的含有Sumo-Hep I-His的工程菌進(jìn)行上罐發(fā)酵培養(yǎng)，離心菌液獲得菌體用超聲細(xì)胞破碎方法獲得肝素酶粗酶液，根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定粗酶液中蛋白含量。

1.2.2 酶活測(cè)定方法 根據(jù)紫外吸收232 nm法測(cè)定Hep I的酶活[15]，酶活力單位定義（IU）：每分鐘生成1 μmol不飽和糖醛酸所需要的酶量為一個(gè)活力單位。

酶活公式為

其中，A232為波長232 nm下測(cè)定的紫外吸收值；V1為反應(yīng)液的總體積；V2為加入酶的體積；t為反應(yīng)時(shí)間；反應(yīng)的吸光系數(shù)為5.5。

固定化酶的蛋白回收率的計(jì)算公式為

其中，R為蛋白回收率；A為固定化酶的蛋白吸附量；A0為固定化前加入粗酶液的總蛋白量。

1.2.3 固定化酶制備 在10 mL離心管中加入GLK-Gel Ni、Sumo-Hep I-His粗酶液在4℃下攪拌進(jìn)行固定化。對(duì)于固定化條件優(yōu)化，分別控制不同的載體與粗酶質(zhì)量比、反應(yīng)pH以及固定化時(shí)間，具體吸附條件如下：

（1）載體與粗酶液質(zhì)量比的優(yōu)化 4℃條件下，根據(jù)粗酶液中的蛋白含量，按照載體與粗酶質(zhì)量比150∶1、100∶1、50∶1、30∶1、10∶1 的比例進(jìn)行酶固定化，反應(yīng)時(shí)間4 h，固定化pH 7.0。

（2）吸附pH的優(yōu)化 4℃條件下，根據(jù)上述最佳載體與粗酶質(zhì)量比，將GLK-Gel Ni分別加入pH為 5、6、7、8、9、10 的粗酶液中攪拌吸附 4 h 后，再分別用相應(yīng)的緩沖液洗滌，測(cè)定不同pH條件下的固定化酶活。

（3）吸附時(shí)間的優(yōu)化 4℃條件下，根據(jù)上述優(yōu)化條件， 固定化吸附分別2、4、6、8、10 h后， 用PB緩沖液洗滌，測(cè)定不同吸附時(shí)間條件下的酶活。

利用上述的最佳固定化條件，將粗酶純化后進(jìn)一步用于固定化酶制備，得出純化酶的固定化酶活和蛋白回收率。

1.2.4 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì) 對(duì)固定化酶與游離酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH和熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究比較，同時(shí)對(duì)固定化操作穩(wěn)定性以及放置穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。具體如下：

（1）最適反應(yīng)溫度的測(cè)定 將固定化酶和游離酶 分 別 于 21、24、27、30、33、36、39、42、45、48 ℃下測(cè)定酶活，得出最適反應(yīng)溫度。

（2）最適反應(yīng)pH的測(cè)定 將固定化酶和游離酶分別在最適反應(yīng)溫度條件下，當(dāng)pH分別為5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6、9.0 的酶反應(yīng)底物時(shí)測(cè)定酶活，得出最適反應(yīng)pH。

（3）熱穩(wěn)定性分析 將固定化酶和游離酶分別放在30℃的恒溫水浴鍋中不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)剩余酶活。

（4）固定化酶的重復(fù)利用性 根據(jù)酶活測(cè)定方法，每次反應(yīng)20 min，測(cè)得A232計(jì)算固定化酶的酶活，連續(xù)重復(fù)操作8次，計(jì)算每次反應(yīng)后固定化酶的剩余酶活。

（5）固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 將固定化酶和游離酶放在4℃冰箱，每隔一段時(shí)間測(cè)定其酶活，計(jì)算剩余酶活。

（6）GLK-Gel Ni重復(fù)利用性 將固定上酶的載體用高濃度咪唑洗脫掉酶，然后再重復(fù)固定酶，測(cè)固定化酶活，以上操作重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 載體與粗酶質(zhì)量比的優(yōu)化 由圖1結(jié)果可知，當(dāng)酶與載體比例在1∶30時(shí)，固定化酶活達(dá)到8.34±0.2 IU/ml載體， 蛋白回收率為 （31.83±0.891）%。固定化過程中加入的酶量過多時(shí)，載體表面容易聚集多層酶，形成空間障礙或擴(kuò)散限制效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致酶的活性位點(diǎn)與底物接觸不充分，所以酶的催化效率降低；而載體與粗酶質(zhì)量比適中時(shí)，吸附在載體上的酶分子較少，使其能夠充分利用其活性位點(diǎn)，但是過少時(shí)，酶量不夠，固定化效果也不佳，因此在酶與載體比例為1∶30時(shí)固定化效果最好。

圖1 載體與粗酶質(zhì)量比對(duì)吸附的影響Fig.1 Effect of weight ratio between support and rude enzyme on adsorption process

2.1.2 吸附pH的優(yōu)化 固定化環(huán)境的pH是影響酶固定化的一個(gè)不容忽視的因素。由圖2可知，pH為7.0時(shí)固定化酶活達(dá)到最高，為8.52±0.24 IU/mL載體，同時(shí)酶活回收率達(dá)到（32.27±0.881）%。載體一般在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)的最大吸附量[16]。Hep I的等電點(diǎn)為8.5，然而在此pH下，固定化酶活沒有達(dá)到最高，從圖2可看出，pH在7～9之間固定化酶活比較高，而在酸性環(huán)境下，固定化效果明顯降低，這可能是pH影響了酶的結(jié)合基團(tuán)或催化基團(tuán)，導(dǎo)致沒有得到理論結(jié)果，而pH 7.0正好是載體的吸附能力與Sumo-Hep I-His的活性的平衡點(diǎn)，故固定化pH控制在7.0。

圖2 固定化pH對(duì)吸附的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption process

2.1.3 吸附時(shí)間的優(yōu)化 由圖3可知，隨著吸附時(shí)間的延長，固定化酶活不斷提高，在固定化時(shí)間6 h時(shí)固定化酶活達(dá)到最高，其酶活和酶活回收率分別達(dá)到 10.07± 0.35 IU/mL載體和 （38.76±0.964）%。時(shí)間繼續(xù)延長，在10 h后固定化酶活有所下降，原因在于吸附一定時(shí)間后酶吸附量達(dá)到飽和狀態(tài)，隨著時(shí)間的延長，載體上吸附的酶因?yàn)槲讲焕喂潭鴱妮d體上脫離，而且吸附時(shí)間過長導(dǎo)致酶本身部分失活，故控制最佳反應(yīng)時(shí)間為6 h。

圖3 吸附時(shí)間對(duì)吸附的影響Fig.3 Effect of adsorption time on the adsorption process

2.1.4 GLK-Gel Ni與其他載體固定化效果比較本研究將Ni2+螯合的瓊脂糖凝膠載體（GLK-Gel Ni）與其他載體進(jìn)行了比較（表1）。GLK-Gel Ni的固定化效果遠(yuǎn)高于其他兩種載體，固定化酶活是硅膠的2倍，是Bettsep Ni的1.5倍，但是蛋白吸附量相比于硅膠和Bettsep Ni并未提高，說明可能是GLKGel Ni的特異性比較好，故固定化比酶活也高于其他兩個(gè)載體。但是3種固定化酶的酶活均沒有達(dá)到預(yù)期的效果，可能是使用粗酶進(jìn)行固定化，雜蛋白在一定程度上阻礙了酶與載體的吸附。針對(duì)這一問題，將純化后的Hep I固定于GLK-Gel Ni，固定化酶活達(dá)到17.93 IU/mL載體，蛋白回收率為40.17%，說明雜蛋白對(duì)酶的固定化具有一定的空間阻礙作用。

表1 GLK-Gel Ni與其他載體固定化效果比較Table 1 Comparison of immobilization effect between GLK-Gel Ni and other supports

2.2 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 溫度對(duì)肝素酶I活力的影響 由圖4可看出，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度分別在30℃和33℃，且在同一溫度下固定化酶的相對(duì)酶活總是高于游離酶，說明酶經(jīng)固定化后耐熱性明顯提高。最適反應(yīng)溫度的提高有可能是因?yàn)槊附?jīng)固定化后，酶活性中心的氨基酸殘基、其所帶的電荷及高級(jí)結(jié)構(gòu)等發(fā)生了改變，從而使固定化酶的最適反應(yīng)溫度高于游離酶。

圖4 溫度對(duì)肝素酶I活力的影響Fig.4 Effect of temperature on Hep I activity

2.2.2 pH對(duì)肝素酶活力的影響 由圖5可看出，固定化酶的曲線始終在游離酶的上方，說明固定化酶對(duì)反應(yīng)pH的耐受性比游離酶好，但是固定化酶和游離酶都在pH 7.0時(shí)酶活達(dá)到最高。本研究中，載體GLK-Gel Ni帶正電，故載體微環(huán)境偏堿性，然而固定化酶的最適反應(yīng)pH并沒有向酸性移動(dòng)，而是和游離酶一致。研究表明最適反應(yīng)pH不僅與載體帶電性有關(guān)，還與酶特性、反應(yīng)底物、反應(yīng)產(chǎn)物、酶構(gòu)象改變等因素都有關(guān)系[17]。

2.2.3 熱穩(wěn)定性分析 固定化酶最重要的優(yōu)點(diǎn)之一就是相對(duì)于游離酶其穩(wěn)定性增強(qiáng)，故本研究考察了酶在30℃下酶的失活速度，結(jié)果如圖6所示。游離酶在30℃下1 h酶活降到了50%，而固定化酶在30℃下1 h仍保持了90%以上的酶活，8 h后才達(dá)到固定化酶的半衰期，即固定化酶的熱穩(wěn)定性相比于游離酶提高了7倍。原因可能是固定化后酶活力的釋放減緩，并且固定化后限制了酶空間構(gòu)象的改變，從而抑制了酶的自降解，因此酶的熱穩(wěn)定性顯著提高。

圖5 pH對(duì)肝素酶I活力的影響Fig.5 Effect of PH on Hep I activity

圖6 固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of free and immobilized enzymes

2.2.4 固定化酶的重復(fù)利用性 如圖7所示，隨著固定化酶的重復(fù)利用次數(shù)的增加，固定化酶的相對(duì)酶活緩慢下降，反應(yīng)8次后，剩余酶活75.8%。表現(xiàn)出較好的重復(fù)利用性，由此可知，該固定化酶在制備低分子量肝素的過程中可以保持良好的活性，充分利用酶。

2.2.5 固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 游離酶在4℃冰箱放置5 d后，酶活降低了50%，之后迅速下降，而固定化酶在放置30 d時(shí)，酶活仍保持了初始酶活的90%，放置60 d還剩75%酶活，之后相對(duì)酶活下降明顯（圖8）。上述固定化酶與游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的差異表明酶經(jīng)固定化之后，其儲(chǔ)存穩(wěn)定性得到了顯著提高，這對(duì)于固定化酶用于工業(yè)生產(chǎn)提供了重要保證。

圖8 固定化酶與游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized and free enzymes

2.2.6 GLK-Gel Ni的重復(fù)利用性 從圖9可以看出，GLK-Gel Ni在洗脫重復(fù)固定后5次后，其固定化酶活仍保持了原始酶活的88.9%，而且曲線下降緩慢，顯示了GLK-Gel Ni良好的重復(fù)利用性。

圖9 GLK-Gel Ni的重復(fù)利用性Fig.9 Recyclability of GLK-Gel Ni

3 結(jié)語

本研究通過利用GLK-Gel Ni對(duì)Sumo-Hep IHis親和吸附作用將酶固定到載體上，通過固定化條件優(yōu)化，固定化酶酶活達(dá)到10.07±0.35 IU/mL載體。此外固定化酶在30℃的熱穩(wěn)定性比游離酶提高了7倍，在4℃的儲(chǔ)存穩(wěn)定性也得到顯著提高，在60 d后，仍保持了75%的初始酶活，而且酶的重復(fù)利用性良好。Sumo-Hep I-His的這種固定化方法成功解決了肝素酶在實(shí)際應(yīng)用中穩(wěn)定性差、快速失活等缺陷，且該固定化酶可以多次重復(fù)利用，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。