重組嗜熱乳糖酶在畢赤酵母中的表達、純化與活性分析

李洪波， 羅海燕， 張樹琴， 吳東海

（1.懷化學院 生命科學系，民族藥用植物資源研究與利用湖南重點實驗室，湖南 懷化 418000；2.中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，廣東 廣州510530）

隨著年齡的增長，人體內乳糖酶活性呈規律性減退，產生乳糖不耐。據報道，我國超過一半的成年人有乳糖不耐受癥狀。乳糖酶是一種高效的生物催化劑，其在乳制品行業中不可替代。β-乳糖苷酶（βgalactosidase，EC 3.2.1.23），又稱乳糖酶，能將乳或其制品中的乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，降低乳制品中乳糖含量?；盍?、耐高溫重組乳糖酶的開發有助于簡化乳糖轉化工藝、降低生產成本、增加乳制品的附加值并擴大乳制品的適宜人群，有利于乳制品的普及、增加乳制品營養的吸收。乳糖酶多從酵母、曲霉或乳酸菌中提取獲得，但由于耐熱性差，嚴重影響其應用。耐高溫乳糖酶能夠克服這缺陷，從耐高溫古細菌中分離熱穩定性好的乳糖酶并克隆其基因，利用外源基因表達系統高效表達這些外源基因已成為研究和利用這些酶的重要突破點[1-5]。在外源基因表達系統中，畢赤酵母表達系統具有許多優點，例如：操作簡易、易于培養、生長速度快、表達量高、酵母表達載體含分泌型信號肽利于胞外表達，高密度發酵生產成本低且該系統的安全性已得到美國FDA認可[6-8]。激烈熱球菌雖然實現了在酵母中的分泌表達，但重組蛋白的純化仍較復雜，本研究將利用畢赤酵母表達系統分泌表達帶有組氨酸標簽（His×6）的重組蛋白、純化并檢測其活性，為其耐熱機理及其他方面活性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

P.furiosus乳糖酶（Lac）cDNA由佛羅里達大學李侍武教授饋贈，表達載體pPICZαA和表達菌株X-33由本實驗室保存。PCR試劑及工具酶為TaKaRa產品；鎳親合樹脂（Ni-NTA）購自Qiagen，抗體均購自CST公司，其他試劑為Sigma分析純產品。培養基及配制參見畢赤酵母表達系統操作手冊（Version E，010302/25-0150，Invitrogen）。

1．2 方法

1．2．1 載體的構建及轉化酵母 據P.furiosus乳糖酶 cDNA（GenBank Accession No：gb|AF013169.2|），設 計 引 物 F：5′-GCCTCGAGAAAAGAATGAAGTT CCCAAAAAACTTC-3′和 R：5′-GCTCTAGATTT CTTGTAACAAATTTG-3′，PCR 擴增目的基因、構建質粒 pPICZαA/Lac并測序。pPICZαA/Lac經 Sac I線性化后參照畢赤酵母表達系統操作手冊LiCl法轉化酵母，涂布 YPDZ（Zeocin 100 mg/L），28 ℃培養3 d，將YPDZ平板上生長的酵母菌用2 mL液體YPD洗下、稀釋并涂布到高濃度YPDZ平板（Zeocin 500 mg/L），28℃培養3 d，隨機挑取轉化子單菌落劃線接種于YPDZ平板，28℃培養3 d，利用通用引物5′-Factor和3′-AOX1對轉化子進行PCR驗證。

1．2．2 小量表達及產物驗證 轉化子單菌落接種至10 mL BMGY，28℃、250 r/min培養過夜。取2 mL過夜菌于200 mL BMGY中，同上條件培養至A600=10左右；1 500 g、5 min離心得菌體。40 mL BMMY重懸菌體，500 mL三角瓶中，28℃、250 r/min誘導培養；每24 h取樣1次并補甲醇至終體積分數1%，誘導4 d。測定上清酶活，SDS-PAGE分析上清中的蛋白，以抗His×6小鼠單抗為一抗，HRP標記山羊抗小鼠IgG為二抗，Western blotting檢測目標產物。

1．2．3 擴大培養及蛋白純化 按小量培養的方法，BMGY培養基培養1.2 L菌液，120 mL BMMY重懸菌體，誘導4 d后離心取上清，1 M Tris調節pH至8.0，15 000 g離心 10 min。參照文獻[6]，將上清轉至經20 mL緩沖液A平衡的鎳柱，過柱后100 mL緩沖液B（緩沖液A含30 mmol/L咪唑）漂洗純化柱，10 mL濃度分別為50、100、200和 300 mmol/L咪唑的緩沖液A洗脫。變性條件下，10%SDS-PAGE分析。純化的重組蛋白經PBS透析后經超濾濃縮后備用。

1．2．4 酶學性質分析 配制pH 4～7的緩沖液，將ONPG溶于緩沖液（0.25%），于65℃測定酶活（牛奶巴氏滅菌溫度下）。溫度對酶活的影響：于40～100℃的水浴和105～120℃數顯恒溫油浴鍋中，經1 h水浴后測定酶活。金屬離子的影響：65℃、pH 6.5下，加入不同的金屬離子和相關化學試劑（終濃度為1 mmol/L）測定酶活。酶比活測定：將酶蛋白質量濃度調整至 100 μg/mL，分別取 1、3、5 μL 添加至含有10 mL 0.25%ONPG的試管中，于最適條件下反應0.5 h測定并分析其比活。

1．2．5 乳糖水解分析 乳清粉配成一定濃度的溶液，100 ℃加熱 15 min，6 000 r/min離心 10 min，取上清。調整乳糖濃度為5%，將純化的酶蛋白質量濃度調整至 1 mg/mL，取 0、10、20、40 和 50 μL 添加至含有10 mL乳清溶液的試管中，于pH 6.5、65℃下、水解0.5 h，測定乳糖水解度。萊因-埃農氏法（GB/T 5413.5—1997）測定乳糖含量，酶-比色法（GB/T 16285—96）測定葡萄糖含量。水解率計算公式為：乳糖水解率=（生成葡萄糖的質量/原乳糖質量）×100%

2 結果與討論

2.1 重組酵母表達載體的構建及酵母轉化子的篩選

Xho I和 Xba I雙酶切，電泳結果如圖 1（a）所示，重組載體在15 00 bp處有DNA條帶，該條帶與目標基因大小相符 （泳道2）且測序結果與Gene Bank的序列一致，說明重組載體構建成功。隨機挑取4個酵母轉化子，PCR分析結果如圖圖1（b）所示，重組質粒轉化子在約1 800 bp處存在特異條帶（泳道3～6），而X-33出發菌株對照未出現特異擴增條帶（泳道1），空載體轉化子在約270 bp處存在條帶（泳道 2），由于利用通用引物 5’-Factor和 3’-AOX1 PCR所得片段較目標基因大270 bp左右，PCR結果說明目標基因已成功插入到畢赤酵母基因組。

圖1 載體的構建及轉化子的驗證Fig.1 Expression vector construction and PCR results of lactase P.pastoris transformants

2．2 小量表達及產物驗證

甲醇誘導前，檢測不到酶活，誘導24 h后的酶活達31 U/mL，誘導96 h酶活達到了125 U/mL（圖2）。SDS-PAGE分析結果顯示，在約55 kDa處有與目標蛋白大小相符的條帶（圖3），Western blot也顯示在目標蛋白位置，出現了特異條帶（圖2）。SDSPAGE及蛋白印跡條帶與預期重組乳糖酶的分子量大小相符。

2．3 重組蛋白的純化

SDS-PAGE結果表明40和100 mmol/L咪唑的緩沖液A可將大部分雜蛋白漂洗掉，含200及300 mmol/L咪唑的緩沖液能將目標蛋白洗脫，當咪唑濃度為300 mmol/L時目標蛋白被大量洗脫且幾乎沒有雜蛋白（圖4），Quantity One軟件灰度分析結果表明，當咪唑濃度為300 mmol/L，洗脫液中目標蛋白純度超過95%。SDS-PAGE分析結果表明，利用鎳親合純化可以快速將目標蛋白分離純化。純化前誘導液總酶活達1.2×104U，酶比活力為320 U/mg，300 mmol/L咪唑洗脫后總酶活為3.3×103U，酶比活力約1 740 U/mg，經透析和超濾濃縮后，酶比活約1 800 U/mg，酶被純化了5.6倍，各步純化效果如表1所示。

圖2 酶活變化曲線Fig.2 Enzyme activity curve

圖3 目標蛋白的檢測Fig.3 Identification of target protein

圖4 重組乳糖酶的純化Fig.4 Purification of recombinant lactase

表1 重組乳糖酶的純化Table 1 Purification of recombinant lactase

2．4 酶特性分析

酶活溫度曲線如5所示，105℃時重組酶的活力最高。酶活pH曲線如圖6所示，pH 6.5左右酶活最高。 Cu2+、Fe2+、Mn2+和 Zn2+對乳糖酶有激活作用，Fe2+效果最明顯，其相對酶活達到50%；EDTA、K+、Mg2+和Ca2+對酶的抑制作用不顯著（圖7）。酶比活力測定分析結果表明，該酶的比活達為1 850 U/mg。純化酶的耐熱性分析結果表明，該酶具有良好的熱穩定性，經100℃處理2 h酶活在90%以上，100℃處理4 h酶活在70%以上（圖8）。

圖5 乳糖酶的溫度曲線Fig.5 Optimum temperature curve of lactase

圖6 乳糖酶的pH曲線Fig.6 Optimum pH curve of lactase

2．5 乳糖水解分析

乳糖酶的使用量與乳糖水解率的關系如圖9所示，當重組酶添加量為37 U/g乳糖時，乳糖的水解度為16%；當乳糖酶的使用量為185 U/g乳糖時，乳糖的水解度達67%。以上結果說明，在巴氏滅菌條件下（65℃保溫0.5 h），純化的乳糖酶具有良好的水解乳糖活性。

圖7 金屬離子對酶活的影響Fig.7 Effect of metal ions to recombinant lactase activity

圖8 乳糖酶的熱穩定性曲線Fig.8 Thermostability curve of recombinant lactase

圖9 乳糖水解分析Fig.9 Degree of hydrolysis of lactose

3 討 論

國內外已有不少關于耐高溫乳糖酶的研究報告[9-14]。段文娟等分別利用大腸桿菌表達了與本研究相同的乳糖酶基因，但其利用大腸桿菌表達系統表達的嗜熱乳糖酶的酶活力較低且表達的重組酶存在于胞內，增加了蛋白分離純化的工藝，不適于工業化生產[3，15]。Dong等[3]利用大腸桿菌表達的該重組酶經復性后才具有生物活性，但比活較酵母分泌表達的重組酶要低得多，且該復性酶的耐熱性下降，其最適溫度為90℃，最適pH為7，較本研究和Li等[2]表達的重組酶最適pH高，說明酵母表達系統較大腸桿菌更適于生產該重組酶。本研究利用畢赤酵母表達系統，在甲醇誘導下，重組嗜熱乳糖酶在該表達系統中高水平分泌表達，搖甁小量培養條件下，經甲醇誘導的培養基上清液中的酶活達125 U/mL。該重組乳糖酶在pH 6～7間的酶活都在85%以上，該pH范圍與天然牛乳的pH接近，且該酶具有廣泛的溫度適用范圍；同時，以乳清為原料，在巴氏滅菌條件下，該酶表現出良好的水解乳糖活性。以上結果都表明酵母表達系統表達的重組嗜熱乳糖酶在牛奶加工中具有廣闊的應用潛力。

Li等[2]利用GAP為啟動子，實現該酶組成型分泌表達，Li在高密發酵條件下酶產量約0.7 g/L，其高密發酵條件下菌體密度約為本研究50倍，目標產物為本研究10倍左右，說明以AOX1為啟動子，在甲醇誘導下其表達量可能要高于GAP啟動子；另外，酶學特性分析表明，本研究表達C-未端帶組氨酸標簽重組酶的酶學性質（最適pH、最適溫度及熱穩定性）與不帶組氨酸標簽基本一致。大多數蛋白的純化步驟較多且過程繁瑣，獲得高回收率、高純度蛋白的理想方法是盡量減少組化的步驟，本研究在目標蛋白的C端引入了組氨酸標簽，上清液經調節pH后直接用于純化，經鎳親合純化后，優化洗脫條件，可以實現一步純化獲得高純度的酶蛋白，該方法較離子交換更為簡單，較利用熱變性的方法去除其他蛋白更能保護酶的活性，有利于研究該酶的其他酶學特性、開展其他應用方面的分析及為其耐熱機理等研究打下了良好的基礎。