肉桂提取物對銅綠假單胞菌生物膜產生的抑制作用研究

綦國紅， 陳金輝， 陳貴堂， 楊志萍， 王海翔， 王歲樓

（中國藥科大學 工學院，江蘇 南京 211198）

很多革蘭氏陽性菌通過產生自誘導的小分子信號物質N-酰基高絲氨酸內酯（N-Acyl homoserine lactones，AHLs），以群體感應（Quorum sensing，QS）方式調控某些性狀的表達，如生物浮游、生物膜的形成、毒性因子的表達等[1]。研究表明一些食源性致病菌的致病性以及腐敗菌的腐敗特性也受群體感應現象調控。如果存在于食品及食品機械上的腐敗性細菌通過產生由QS現象調控的生物膜進行自我保護，將降低殺菌劑或抑菌劑的作用效果[2]。因此，以調控這些菌的QS現象為切入點來控制腐敗菌腐敗特性成為可能，即利用群體感應抑制劑（Quorum sensing inhibitors，QSIs）來抑制由QS調控的因子的表達[3-5]。其機制不同于目前抑菌或殺菌的原理，而是通過阻斷其群體感應通路來減少腐敗因子的表達，從而降低其致腐性能，與抑菌劑共同使用，可以降低抑菌劑的使用濃度，為新型生物防腐劑的開發提供新思路。

最早發現的革蘭氏陰性菌群體感應抑制劑是源于海洋紅藻的呋喃酮類化合物，但此化合物具有毒性[6]，因此從食品原料中尋找群體感應抑制劑成為此領域研究的熱點[7-10]。

肉桂（Cinnamomum cassia）為樟科植物肉桂的干燥樹皮，是衛計委公布的藥食兼用植物材料，產于廣東、廣西、云南等地，《神農本草經》記載：其“味產溫，主百病，養精神，和顏色，利關節，補中益氣，為諸藥先聘通使，久服通神，輕身不老”。肉桂對皮膚真菌有很強的抑制作用，對大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌也有明顯的抑菌作用[11]。因其氣香濃烈，味甜、辣，因此可用作香料，還可作為食品添加劑加入到肉制品中。

我國是肉桂的高產國，國內對肉桂的研究不在少數，但關于肉桂在細菌群體感應抑制方面的研究還未見報道。本文以群體感應抑制研究的模式菌銅綠假單胞菌PAO1為受試菌，研究肉桂提取物對其生物膜產生的影響，為肉桂資源的深度開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂，購自南京同仁堂藥店；二甲基亞砜（AP），上海泰坦化學有限公司；卡那霉素，江西鑫瑞動物藥業有限公司；N-己酰高絲氨酸內酯（N-hexanoylhomoserine lactone，C6-HSL），sigma 公司。

1.2 儀器與設備

Nikon 80I熒光顯微鏡，日本尼康；FLX800酶標儀，美國寶特；CR21G高速冷凍離心機，日立；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器；RE-5205旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；JY92-2N細胞破碎儀，浙江寧波新芝科技公司。

1.3 菌種與培養條件

紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CVO26、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1均為本實驗室保存。均使用LB培養基（氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，水1 L）培養。紫色桿菌CVO26培養時添加卡那霉素至終質量濃度為20 μg/mL。

1.4 方法

1.4.1 肉桂提取物的制備 肉桂于50℃烘干，粉碎，過40目多孔篩，密封保存備用。稱取10 g肉桂粉，加入100 mL 75%的甲醇，600 W超聲破碎20 min，靜置24 h，得上清液。沉淀物加入100 mL 75%的甲醇繼續靜置24 h。將兩次提取的上清液混合，離心，上清液于旋轉蒸發儀35℃旋蒸至干，再加入2%二甲基亞砜，定容至10 mL，10 000 r/min離心5 min取上清液，裝入無菌離心管中-22℃冷凍保藏備用。

1.4.2 最小抑菌濃度的測定 根據文獻[12]采用濾紙片法測定肉桂提取物對紫色桿菌CVO26和銅綠假單胞菌PAO1最小抑菌濃度，方法如下：待測菌活化兩次后，按2%的接種量接種于新鮮LB液體培養基中，28℃振蕩培養至菌液OD600nm約為0.4時，將等體積1.5%的固體LB培養基迅速倒入菌液中，搖均，倒平板，制成含菌（約1×108cfu/mL）平板。將滅菌濾紙片（直徑6 mm）置于不同濃度提取液中浸泡5 min，瀝干，貼在平板上，28℃培養24 h，觀察濾紙片周圍的抑菌圈，無菌水做對照，每個濃度做3個平行。以不出現抑菌圈的最大濃度作為MIC。

1.4.3 生長曲線的測定 根據文獻[2]待測菌活化后，按2%比例接種新鮮LB培養基，振蕩培養至OD600nm為0.4，加入不同濃度的提取物后，28℃振蕩培養，每隔2 h測定OD600nm值，每個濃度做3個平行，取平均值，繪制生長曲線。

1.4.4 紫色桿菌CVO26紫色素的測定 根據文獻[2]，菌體培養至OD600nm為0.4，取9 mL菌液于錐形瓶中，加入1 mL不同濃度的提取物，添加C6-HSL終濃度為5 μmol/mL，28℃過夜振蕩培養。無菌水為對照。

取3 mL培養液，10 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL二甲基亞砜，充分振搖，于10 000 r/min離心10 min，取上清，580 nm處測定吸光值。按下式計算抑制率：

1.4.5 銅綠假單胞菌PAO1生物膜的定性與定量測定 根據文獻[13]銅綠假單胞菌PAO1接入LB培養基中，再加入一定濃度的提取物，用無菌剪刀將醫用無菌輸液管剪成0.5 cm×0.5 cm大小的管片，將管片置于培養基中，37℃下靜置培養。48 h后用移液器取出培養基，再加入新鮮LB液體培養基和提取液，繼續培養48 h。取出輸液管片，用無菌水沖洗，0.2%的結晶紫溶液染色2 min，40℃烘干。取一個輸液管片置于離心管中，加入400 μL 95%乙醇浸泡3 min，移取300 μL乙醇洗脫液至96孔板中，酶標儀測定630 nm波長處的吸光度。生物膜抑制率的計算方法見1.4.4節。另外，干燥的輸液管片固定于載玻片上，光學顯微鏡（400×）下觀察生物膜概貌，拍照。

2 結果與分析

2.1 提取物對紫色桿菌CVO26、銅綠假單胞菌PAO1的最小抑菌濃度（MIC）

通過濾紙片法分別測定了肉桂提取物對紫色桿菌與銅綠假單胞菌的MIC，結果表明對紫色桿菌的MIC為100 mg/mL，而銅綠假單胞菌在100 mg/mL時也無抑制作用，下述實驗提取物的質量濃度全部在100 mg/mL以下進行。

2.2 提取物對紫色桿菌和銅綠假單胞菌生長的影響

為進一步證明提取物在MIC濃度以下對紫色桿菌與銅綠假單胞菌的生長是否產生影響，在添加提取物的條件下對其生長曲線進行測定。由圖1、2可知，紫色桿菌CVO26與銅綠假單胞菌PAO1在添加不同濃度肉桂提取物條件下的生長與無菌水相比基本同步，不存在生長延遲現象。因此，提取物在試驗濃度下對二菌沒有抑制作用。

2.3 提取物對紫色桿菌紫色素產生的抑制作用

圖1 肉桂提取物對紫色桿菌CVO26生長的影響Fig.1 Effect of cinnamon extract on C.violaceum CVO26 growth

圖2 肉桂提取物對銅綠假單胞菌PAO1生長的影響Fig.2 Effect of cinnamon extract on P.aeruginosa PAO1 growth

紫色桿菌產生紫色的能力是由群體感應現象調控的，CVO26不產生C6-HSL，也不產生紫色，在添加了C6-HSL和提取物的條件下進行培養，提取物對CVO26群體感應的抑制作用可以通過檢測其紫色素的產生量進行判定。培養物處理后，可以看到不同濃度肉桂提取物對紫色桿菌產生的紫色素量有明顯影響（圖3），試驗濃度下提取物對CVO26紫色素的產生均有抑制作用，且隨著肉桂提取物濃度的升高而增強，80 mg/mL時其抑制率可達95.45%（圖4），因此提取物在不影響CVO26生長的情況下具有很好的抑制其群體感應作用。

圖3 肉桂提取物對紫色桿菌CVO26紫色素產生的抑制作用（定性）Fig.3 Violacein production inhibition in C.violaceum CVO26 by cinnamon extract （qualitative）

圖4 肉桂提取物對紫色桿菌CVO26紫色素產生的抑制作用（定量）Fig.4 Violacein production inhibition in C.violaceum CVO26 by cinnamon extract（quantitative）

2.4 對銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的抑制作用

對PAO1形成的生物膜通過光學顯微鏡進行觀察發現，加入肉桂提取物的輸液管片與對照相比，形成較少的菌團單位，細胞密度減少，提取物質量濃度在40 mg/mL時，形成的生物膜不完整，膜上的細胞密度與菌團單位非常稀疏（圖5）。

為對形成的生物膜進行定量測定，把輸液管片上的生物膜用乙醇進行洗脫，并測定洗脫液OD630nm值，計算抑制率。由圖6可知，對銅綠假單胞菌產生的生物膜的抑制率隨肉桂提取物濃度的升高而升高，說明生物膜的形成量隨提取物濃度的升高而減少。因此，通過定量與定性試驗結果表明，肉桂提取物在不抑制銅綠假單胞菌PAO1生長的情況下，對其生物膜的形成具有很好的抑制作用。

圖5 銅綠假單胞菌PAO1產生的生物膜概貌（400×）Fig.5 Microscopic images of biofilms by P.aeruginosa PAO1 （400×）

圖6 肉桂提取物對PAO1生物膜產生的抑制作用（定量）Fig.6 Biofilm production inhibition in P.aeruginosa PAO1 by cinnamon extract（quantitative）

3 結語

根據文獻[14]，肉桂提取物具有很強的抑菌作用，但本試驗樣品通過甲醇提取后，再用2%二甲基亞砜進一步分離，其抑菌作用較弱。本文研究了此提取物對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響，結果表明，在不抑制PAO1生長的情況下，降低了其生物膜的產生量，以及生物膜上菌團密度，而銅綠假單胞菌PAO1的這一特性受QS現象調控，因此證明，肉桂提取物對PAO1生物膜形成的抑制作用不是由抑菌所致而是對其QS現象的干擾所致。

據文獻 [14]肉桂甲醇提取物中含有1.49 mg/g的肉桂醛，而肉桂醛可溶于二甲基亞砜，肉桂醛的分子結構與自誘導物AHL的結構具有相似性，根據國外文獻[15]報道，肉桂醛具有群體感應抑制活性，因此推斷本試驗提取物對PAO1的QS具有干擾作用的化合物可能是肉桂醛，提取物有效成分分離與鑒定工作將做進一步研究。