基于ARTP技術(shù)快速選育番茄紅素高效合成突變株

羅 瑋， 周 雅， 鞏尊洋， 杜 瑤， 余曉斌

（江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

番茄紅素 （lycopene）是一種重要的類胡蘿卜素，具有極強(qiáng)的抗氧化和清除自由基能力，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域[1]。目前番茄紅素的生產(chǎn)方法主要包括天然提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[2]。天然提取法獲得的番茄紅素產(chǎn)量不高，成本高且受制于原料來源；化學(xué)合成法存在安全隱患，而微生物發(fā)酵法具有工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到關(guān)注[3]。三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是一種絲狀真菌，其番茄紅素含量很高，是生產(chǎn)番茄紅素的理想微生物[4]。但是其番茄紅素發(fā)酵水平與大規(guī)模生產(chǎn)的要求仍然存在較大距離，因此獲得優(yōu)良菌種以提高番茄紅素產(chǎn)量迫在眉睫。

常壓室溫等離子體 （atmospheric and room temperature plasma，ARTP）生物誘變技術(shù)是最近十幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)新型的基于物理學(xué)原理的育種技術(shù)。常壓室溫等離子體是指在大氣壓條件下產(chǎn)生的溫度在25～35℃之間的、具有高活性、高濃度粒子（主要包括氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）的等離子體射流。ARTP具有活性粒子種類多樣且濃度高、誘變效率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而且ARTP本身對(duì)環(huán)境也無污染和危害[5]。已有研究表明，ARTP可以高效快捷地使細(xì)菌、微藻、真菌、酵母等微生物發(fā)生突變，并且能夠獲得豐富的突變表型[6-8]，為選育獲得性能優(yōu)良菌株提供了有效的方法。

本研究利用ARTP等離子體生物誘變系統(tǒng)處理三孢布拉霉負(fù)菌孢子，通過平板肉眼觀察顏色變化初篩和搖瓶復(fù)篩快速獲得番茄紅素高產(chǎn)突變菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅素奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：恒溫培養(yǎng)箱、可見光分光光度計(jì)、恒溫?fù)u床、pH儀、ARTP等離子體誘變系統(tǒng)（北京思清源生物科技有限公司）、離心機(jī)、抽濾機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)真空干燥器等。

試劑：番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司，磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、棉籽油、稀鹽酸、稀氫氧化鈉、二甲基咪唑、石油醚、二氯甲烷、氫氧化鉀溶液（1 mol/L）、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，均為分析純。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

三孢布拉霉菌（B.trispora）由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

固體培養(yǎng)基：麥汁4°，瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基：玉米粉25 g/L，黃豆粉50 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.3，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉50 g/L，黃豆粉26 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.3， 棉籽油36 g/L，121℃滅菌20 min。

1.3 ARTP誘變處理方法

利用清華大學(xué)化工系自主研發(fā)的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)（ARTP）對(duì)三孢布拉霉負(fù)菌孢子（溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉）懸浮液進(jìn)行誘變。ARTP電源功率設(shè)置為115 W，工作氣流為10 L/min，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為2 mm，樣品量為10 μL，操作溫度25～35℃，設(shè)置不同誘變處理時(shí)間。為了獲得最適處理時(shí)間，須制備致死率曲線。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，200 s以下的處理時(shí)間，致死率較低，難以獲得大量突變株。因此處理時(shí)間設(shè)置為從200 s開始，逐漸增加到960 s，然后對(duì)處理過的樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布平板，通過菌落計(jì)數(shù)來計(jì)算致死率。致死率按如下公式計(jì)算：

致死率（%）=（U-T）/U × 100%

其中，U為未經(jīng)過誘變的對(duì)照菌的總菌落數(shù)；T為經(jīng)誘變處理后對(duì)應(yīng)的總菌落數(shù)。

1.4 篩選方法

初篩：將誘變后的孢子懸液適當(dāng)稀釋后涂布篩選平板，根據(jù)菌落顏色差異，挑選菌落顏色深黃或者紅色的菌株。

復(fù)篩：將三孢布拉霉正菌和經(jīng)過初篩的負(fù)菌按比例混合，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)120 h后測(cè)定番茄紅素的產(chǎn)量。

1.5 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：在無菌條件下，將三孢布拉霉正負(fù)孢子（正菌104個(gè)孢子/mL，負(fù)菌 105個(gè)孢子/mL）分別接入種子培養(yǎng)基，在25℃，180 r/min的條件下，培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將生長旺盛的正負(fù)菌種子液按1：5的比例在無菌的條件下混合，再以20%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25℃，180 r/min的條件下，培養(yǎng)120 h，在培養(yǎng)48 h時(shí)添加0.1 g/L 2-甲基咪唑。

1.6 番茄紅素的提取和測(cè)定方法

發(fā)酵120 h之后，收集菌絲體用蒸餾水洗滌后紗布過濾，40℃真空干燥過夜。干燥后加石英砂研磨破碎菌絲體，用石油醚抽提至菌體無色，合并抽提液，適當(dāng)稀釋后于502 nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算番茄紅素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱量經(jīng)過真空干燥的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，倒入100 mL容量瓶，然后用2.0 mL二氯甲烷溶解番茄紅素，再用石油醚定容至100 mL。番茄紅素的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較差，所以應(yīng)迅速將該番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度，然后分別在502 nm處測(cè)定其吸光度，制作番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.25x-0.075，R2=0.998。

圖1 番茄紅素質(zhì)量濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lycopene between its concentration and absorbance

2.2 ARTP誘變致死率曲線

從圖2可以看出，隨著時(shí)間的增加，致死率迅速增加，在240～400 s時(shí)間范圍內(nèi)致死率在93%上下波動(dòng)；處理時(shí)間從400 s進(jìn)一步增加到440 s時(shí)致死率急劇下降，440 s之后致死率逐漸回升，當(dāng)誘變時(shí)間增加到720 s以上時(shí)，致死率接近100%并且曲線趨于平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)選擇處理時(shí)間為600 s左右，以期獲得突變位點(diǎn)豐富的突變株。

圖2 ARTP處理三孢布拉霉負(fù)菌的致死率曲線Fig.2 Lethality rate of B.trispora induced by ARTP with different treating time

2.3 突變株的初篩

經(jīng)ARTP誘變系統(tǒng)處理后，將孢子懸液涂布于篩選平板中，肉眼觀察菌落顏色差異，三孢布拉霉的菌落的顏色深淺與其產(chǎn)量呈正相關(guān)性，因此可以根據(jù)單菌落顏色深淺快速篩選潛在高產(chǎn)菌株。如圖3所示，已有多株菌落顏色較深，因此能初步判斷通過ARTP處理后其發(fā)生了正突變，挑選多株顏色較深的菌株在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵以確定其番茄紅素產(chǎn)量。目前的研究表明ARTP誘變技術(shù)可以成功應(yīng)用于多種微生物的育種過程，且正突變率均較高（正突變率可達(dá)到 10%～65%）[8]。

圖3 三孢布拉霉經(jīng)誘變處理后在平板生長的菌落Fig.3 Colony of B.trispora in growth plate after mutation treatment

2.4 突變株的復(fù)篩

將所篩選到的高產(chǎn)菌株和親代菌株分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，考察不同菌株番茄紅素產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。誘變后的菌株的番茄紅素產(chǎn)量與親代相比，均有明顯提高，突變株ARTP-3的番茄紅素產(chǎn)量比親代提高了51.4%，可見ARTP對(duì)三孢布拉霉有很好的誘變效果。三孢布拉霉雌雄異株，負(fù)菌是類胡蘿卜素的主要合成者，正菌與負(fù)菌共培養(yǎng)可相互作用產(chǎn)生一種性激素三孢酸，三孢酸能促進(jìn)負(fù)菌類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)基因表達(dá)和關(guān)鍵酶的酶活[9-11]。因此，正負(fù)菌共培養(yǎng)能極大促進(jìn)負(fù)菌的番茄紅素產(chǎn)量，從而使突變株累積番茄紅素的表型凸現(xiàn)出來。

圖4 不同突變菌株番茄紅素產(chǎn)量Fig.4 Lycopene production in different mutants

2.5 突變株的遺傳穩(wěn)定性

三孢布拉霉呈多核體，一般孢子囊中平均有4～5個(gè)孢子，這樣對(duì)于隱性突變體的篩選和遺傳穩(wěn)定性有很大的影響[12-13]。而且，在生產(chǎn)過程中，該菌經(jīng)多次傳代后，菌體生長速度降低，菌絲變細(xì)且易斷裂，使得番茄紅素產(chǎn)量不斷下降。對(duì)于篩選到的高產(chǎn)菌株，為確保產(chǎn)量的穩(wěn)定性，需要對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株ARTP-3進(jìn)行了連續(xù)7代的傳代實(shí)驗(yàn)和番茄紅素產(chǎn)量測(cè)定。由表1可見，該菌株在第7代時(shí)仍保持較高的番茄紅素合成水平，這體現(xiàn)了該高產(chǎn)菌株良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 突變株ARTP-3的番茄紅素產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性Table 1 Lycopene concentration stability of the mutant ARTP-3 during generation

3 討 論

本研究基于常壓室溫等離子體誘變技術(shù)，快速選育番茄紅素高效合成突變株。首先通過ARTP誘變處理孢子、平板計(jì)數(shù)法建立了ARTP處理致死率曲線，該致死率曲線與經(jīng)其他一般理化誘變處理存在明顯差異，這被認(rèn)為是離子注入誘變所特有的效應(yīng)[14]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)樵诔跏家欢螘r(shí)間內(nèi)，等離子體造成細(xì)胞表面和細(xì)胞骨架損傷使致死率增加，隨著處理時(shí)間延長，染色體損傷加劇，細(xì)胞啟動(dòng)損傷修復(fù)機(jī)制（SOS）使致死率反而稍有降低[15]。SOS修復(fù)是一種旁路系統(tǒng)，它允許新生的DNA鏈越過胸腺嘧啶二聚體而延長，盡量使細(xì)胞存活，但其代價(jià)是保真度的極大降低，所以SOS修復(fù)可導(dǎo)致突變，致使突變位點(diǎn)豐富，易獲得高產(chǎn)突變株[15-16]。隨后誘變時(shí)間繼續(xù)增加，細(xì)胞損傷已無法修復(fù)，致死率再次提升[17]。

對(duì)ARTP誘變技術(shù)的最早應(yīng)用案例是選育阿維菌素高產(chǎn)菌株阿維鏈霉菌，研究者根據(jù)菌落形態(tài)表型變化快速篩選獲得了阿維菌素產(chǎn)量提高18%的高產(chǎn)菌株，其中特異性組分阿維菌素B1a的產(chǎn)量增長了40%[6]。隨后，其他研究者也陸續(xù)開始采用該技術(shù)進(jìn)行微生物菌株的選育。金麗華等[18]采用ARTP誘變圓紅冬孢酵母，篩選到了一些產(chǎn)油量比親代明顯提高的突變株，其產(chǎn)油量由初始1.87%提高到4.07%且生物量也比出發(fā)菌株提高1.5倍。楊穎等[19]利用ARTP誘變綠色糖單孢菌，篩選到木聚糖酶高產(chǎn)菌株。鄭明英等[20]利用ARTP誘變嗜醋酸棒桿菌篩選得到高脯氨酸高產(chǎn)菌株。因此，作為一種快速高效的新型生物誘變育種方法，ARTP技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用于越來越多的微生物菌種選育過程。

經(jīng)誘變處理后，在平板上初步篩選獲得了菌落顏色較深的菌落。由于僅靠肉眼觀察顏色深淺存在一定誤差，本研究進(jìn)一步將負(fù)菌與正菌進(jìn)行混合發(fā)酵，放大了高產(chǎn)突變株與低產(chǎn)或負(fù)突變菌株的番茄紅素產(chǎn)量差值。通過復(fù)篩，獲得了一株ARTP-3突變株，其番茄紅素產(chǎn)量比原始菌株提高了51.4%，達(dá)到0.85±0.04 g/L。目前已有多個(gè)研究小組對(duì)番茄紅素合成的微生物菌株進(jìn)行系統(tǒng)選育。王永生等[21]對(duì)三孢布拉霉進(jìn)行了物理法和化學(xué)法相結(jié)合的誘變方法，使類胡蘿卜素的產(chǎn)量大幅提高了10倍以上，其中番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到400 mg/L。任龍[22]以兩次Co-γ輻射處理三孢布拉霉，選育出兩株高產(chǎn)番茄紅素的突變株，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)661.8 mg/L。王敏等[23]通過紫外誘變龜裂鏈霉菌，篩選到一株突變高產(chǎn)菌株，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)量達(dá)到230 mg/L。本研究同時(shí)對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究，連續(xù)傳代至第6代時(shí)番茄紅素產(chǎn)量仍然較高，表明其具有較高的遺傳穩(wěn)定性，可以滿足應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

因此，本研究利用ARTP誘變系統(tǒng)對(duì)三孢布拉霉進(jìn)行誘變，獲得了番茄紅素高產(chǎn)突變株，ARTP等離子誘變系統(tǒng)比傳統(tǒng)的誘變方法有更高的正向突變效應(yīng)，該研究方法也為其他絲狀真菌的誘變選育提供了參考。