固定化馬來酸順反異構(gòu)酶合成富馬酸

劉文茂 ， 周 麗 ， 周哲敏 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

富馬酸（Fumaric acid）是一種天然存在的四碳平臺有機酸，又稱為反丁烯二酸、延胡索酸，在醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域有著重要的價值[1]。馬來酸 順 反 異 構(gòu) 酶 （EC 5.2.1.1，Maleate cis-trans Isomerase，MaiA）屬于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族[2]，能夠催化馬來酸在碳碳雙鍵不斷裂的情況下異構(gòu)化生成富馬酸。其中，粘質(zhì)沙雷氏菌株來源的馬來酸順反異構(gòu)酶具有轉(zhuǎn)化率高、pH范圍寬泛、Km值較低等特點，被認為是有望用于工業(yè)生產(chǎn)富馬酸的生物催化劑之一[3]。游離酶在用于生物催化反應(yīng)時，具有穩(wěn)定性低、回收利用困難、分離成本高等問題；而固定化酶則具有可重復(fù)利用，能控制反應(yīng)過程，熱穩(wěn)定性好，酶與底物和產(chǎn)物易分離，產(chǎn)物純度高，能降低分離純化成本等優(yōu)點[4-5]。然而，目前尚無馬來酸順反異構(gòu)酶固定化以及用固定化馬來酸順反異構(gòu)酶合成富馬酸的研究報道。

交聯(lián)酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）[6]是一種新型無載體固定化技術(shù)，通過在溶液中使酶蛋白分子發(fā)生物理聚集，隨后利用常規(guī)交聯(lián)劑戊二醛[7]對聚集體進行化學(xué)交聯(lián)，該方法制備過程簡單，但是由于固定化酶全部由酶蛋白組成，其機械強度較差，在實際應(yīng)用中會暴露出很多問題。一方面，CLEAs的粒徑一般都在10 μm以下，這樣就很難通過簡單地離心或過濾從反應(yīng)體系中分離和回收CLEAs。另外，CLEAs壓縮阻力很低，離心和過濾后很難重新均勻地分散到反應(yīng)體系中，使其催化效率下降。

傳統(tǒng)包埋法具有隨機性、包埋效率低、制備過程條件苛刻、時間長、制得的固定化酶顆粒較大導(dǎo)致轉(zhuǎn)化時傳質(zhì)阻力大等缺點[8]。通過對硅藻沉淀硅的機理進行研究，發(fā)現(xiàn)了硅蛋白（silaffins），并篩選出硅蛋白中可以高效沉淀硅的R5短肽[9]，R5肽段在中性pH及常溫條件下，幾秒鐘內(nèi)即可體外誘導(dǎo)硅沉淀，形成自包埋結(jié)構(gòu)[10]。 Lai[11]、Chien[12]、Marner[13]等人應(yīng)用R5肽段在溫和的條件下高效、快速地制備出酶活回收率高、操作穩(wěn)定性好、熱穩(wěn)定性好的固定化酶。但是，本研究前期發(fā)現(xiàn)R5肽段與酶融合后，直接包埋制得的固定化酶顆粒較小不易回收，并且熱穩(wěn)定性也較差。而將交聯(lián)酶聚集體技術(shù)與R5肽段自包埋兩種方法相結(jié)合，即可以解決CLEAs機械強度差、易分散等問題，又可以解決R5肽段直接包埋不易回收、熱穩(wěn)定性差的問題，但目前尚未見類似研究。

本研究利用馬來酸順反異構(gòu)酶合成菌株E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-maiA[14]高效表達馬來酸順反異構(gòu)酶，采用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)與R5肽段自包埋技術(shù)相結(jié)合的方法，制備熱穩(wěn)定性好、操作穩(wěn)定性高的固定化馬來酸順反異構(gòu)酶（Si-CLEAs）；進一步研究固定化馬來酸順反異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)，并將其裝入填充床反應(yīng)器應(yīng)用于富馬酸的合成。該研究為固定化馬來酸順反異構(gòu)酶合成富馬酸的工業(yè)化應(yīng)用提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株與引物

基因工程菌株 E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-maiA、重組質(zhì)粒 pET-24a（+）-maiA 由本實驗室構(gòu)建、保藏。

本文所用引物如下：

primer F：

5'-CCATATGTCCTCCAAGAAATCGGGATCCT ACTCGGGATCCAAGGGTTCCAAGCGTCGCATCTTG ATGAGCAACCACTACCGCATCGGCCAGATC-3'；

primer R：

5'-GCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTA TATCTCC-3'。

1.2 主要試劑

Primer star DNA聚合酶，NdeⅠ限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶等：日本寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；馬來酸，富馬酸，25%戊二醛：BBI Life Sciences；正硅烷甲酯，磷酸二氫鉀，硅藻土：國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組菌株誘導(dǎo)表達及純化方法 將菌株E.coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-R5-maiA 在 LB 固體平板上劃線活化，挑取LB平板上單菌落，接種至5 mL含 50 μg/mL卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中，37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，取500 μL上述培養(yǎng)物接種至50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達到0.8，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，20℃誘導(dǎo)20 h。

收集菌體超聲破碎，12 000 r/min離心10 min獲得粗酶液，粗酶液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后用1 mL的His Trap FF crude柱對重組蛋白進行純化。

1.3.2 馬來酸順反異構(gòu)酶酶活測定方法 取100 μL游離馬來酸順反異構(gòu)酶溶液 （或固定化酶懸浮液），加入50 μL濃度為1 mol/L的馬來酸（KOH調(diào)至8.0）溶液，用Na2HPO4-KH2PO4緩沖液將反應(yīng)體系補加到500 μL，于40℃（固定化酶最適溫度為50℃）保溫10 min。100℃煮沸10 min，離心，取上清液稀釋50倍，測定生成的富馬酸含量。

酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需的酶量定義為1 U。

蛋白質(zhì)定量采用常規(guī)的Bradford法[15]。

Na2HPO4-KH2PO4緩沖液：由1/15 M Na2HPO4母液和1/15 M KH2PO4母液按比例配制不同pH緩沖液。

1.3.3 馬來酸和富馬酸的測定方法 馬來酸和富馬酸濃度用高效液相色譜法測定。HPLC檢測條件：色譜柱 Prevail Organic Acid （250×4.6 mm，5 μm ；GraceDavisonDiscoverySciences），流動相為 25mmol/L的K2HPO4溶液pH=2.5，流速 1 mL/min，柱溫40℃，紫外檢測器，波長210 nm，進樣量10 μL。

1.3.4 固定化酶的制備方法 將馬來酸順反異構(gòu)酶融合酶重組菌株的發(fā)酵液離心，獲得菌體，用Na2HPO4-KH2PO4緩沖液清洗，加入適量Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸菌體至菌懸液的OD600值為35，超聲破碎后離心取上清液，用硫酸銨聚集馬來酸順反異構(gòu)酶融合酶、戊二醛交聯(lián)并用正硅酸甲酯包埋制備固定化酶。具體過程如下：

（1）聚集條件的優(yōu)化。細胞破碎液中逐步添加硫酸銨粉末，分別至飽和濃度為0～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%，置于 4℃下緩慢攪拌30 min，4℃ 10 000 r/min離心10 min，將每個飽和濃度下的沉淀蛋白均用NaHPO4-KH2PO4緩沖液溶解并透析，通過SDS-PAGE判斷每一濃度梯度下目的蛋白含量，確定最佳硫酸銨添加量。

（2）交聯(lián)條件的優(yōu)化。交聯(lián)pH的優(yōu)化：調(diào)節(jié)硫酸銨沉淀后蛋白液 pH 分別至 6.5、7、7.5、8、8.7，滴加戊二醛溶液至終體積分數(shù)為0.1%，在室溫下攪拌交聯(lián)1 h，獲得交聯(lián)酶聚集體，對交聯(lián)酶聚集體酶活進行檢測，確定最優(yōu)交聯(lián)pH值。

交聯(lián)劑戊二醛濃度的優(yōu)化：調(diào)節(jié)硫酸銨沉淀后蛋白液pH至7.5，分別加入戊二醛至終體積分數(shù)為0.025% 、0.05% 、0.075% 、0.1% 、0.125% 、0.18% 、0.3%、0.5%、0.7%、1%，在室溫下攪拌交聯(lián) 1 h，獲得交聯(lián)酶聚集體，對交聯(lián)酶聚集體酶活進行檢測，確定最優(yōu)戊二醛添加濃度。

交聯(lián)時間的優(yōu)化：調(diào)節(jié)硫酸銨沉淀后蛋白液pH至7.5，滴加戊二醛溶液至終體積分數(shù)為0.1%，分別在室溫下緩慢攪拌交聯(lián) 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，獲得交聯(lián)酶聚集體，對交聯(lián)酶聚集體酶活進行檢測，確定最佳交聯(lián)時間。

（3）包埋條件[11]。上述最優(yōu)條件下獲得的交聯(lián)酶聚集體用Na2HPO4-KH2PO4緩沖液洗滌3次，重懸于Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，并且按照硅化反應(yīng)液∶交聯(lián)酶聚集體∶正硅酸甲酯=1∶8∶1 的比例混合（硅化反應(yīng)液為pH=8的0.1 mol/L磷酸氫二鉀和0.1 mol/L氫氧化鈉的混合溶液；正硅酸甲酯濃度為1 mol/L，用 1 mmol/L 的鹽酸配置）[11]，劇烈攪拌 30 s，靜置離心收集固定化酶Si-CLEAs，并用與細胞破碎液等體積的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸。

1.3.5 馬來酸順反異構(gòu)酶固定化酶活力的測定將100 μL Si-CLEAs（用粗酶液作為對照）加入到含有100 mmol/L馬來酸鉀的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液中，反應(yīng)液總體積為0.5 mL，于40℃反應(yīng)10 min后立即用100℃煮沸10 min終止反應(yīng)，適當(dāng)稀釋并用0.22 μm有機濾膜過濾后用高效液相色譜檢測馬來酸和富馬酸的含量，計算出固定化酶的酶活力。

1.3.6 Si-CLEAs的酶學(xué)性質(zhì) 酶促反應(yīng)最適溫度的測定：Si-CLEAs和游離酶分別在 30、35、40、45、50、55、60 ℃、pH 8.04條件下， 反應(yīng) 10 min后測定富馬酸含量，并計算酶活。

酶促反應(yīng)溫度穩(wěn)定性的測定：Si-CLEAs和游離酶分別在55℃、pH 8.04條件下處理，每小時均取樣品測定測定富馬酸含量，并計算酶活。

酶促反應(yīng)最適pH的測定：Si-CLEAs和游離酶分別在 pH 為 5.91、6.47、6.98、7.38、7.73、8.04、8.34、9.18以及反應(yīng)溫度分別為55℃或40℃的條件下，反應(yīng)10 min后測定富馬酸含量，并計算酶活。

Si-CLEAs的操作穩(wěn)定性的測定：Si-CLEAs在最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH下連續(xù)反應(yīng)8次，測定富馬酸含量并計算酶活力，以第一次反應(yīng)的酶活力為100%，分別計算相對酶活力。

1.3.7 固定化酶填充床反應(yīng)器操作過程優(yōu)化及操作穩(wěn)定性 將100 mL的固定化酶懸濁液與200 g硅藻土充分混合后填入玻璃柱反應(yīng)床 （25 cm×3.6 cm，450 mL），利用蠕動泵將底物由下向上泵入反應(yīng)床中，控制催化溫度40℃。

停留時間對富馬酸生產(chǎn)的影響：將濃度為0.6 mol/L馬來酸鉀作為底物，泵入填充床反應(yīng)器中反應(yīng)，并分別控制底物停留時間為0.55、0.67、0.83、1.1、1.67 h，測定富馬酸的產(chǎn)量，計算出富馬酸轉(zhuǎn)化率和體積轉(zhuǎn)化速率，確定最適停留時間。

底物濃度對富馬酸生產(chǎn)的影響：在停留時間為0.83 h 的條件下，分別用濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的馬來酸鉀進行轉(zhuǎn)化，測定富馬酸的產(chǎn)量，計算出富馬酸的轉(zhuǎn)化率和體積轉(zhuǎn)化速率，確定最佳底物濃度。

固定化酶填充床反應(yīng)器操作穩(wěn)定性：以優(yōu)化后的停留時間和底物濃度進行富馬酸連續(xù)生產(chǎn)，運行15批次，計算每個批次的底物轉(zhuǎn)化率，由轉(zhuǎn)化率的降低程度評估反應(yīng)器的操作穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬來酸順反異構(gòu)酶融合酶R5-MaiA的克隆、表達

對文獻[9]報道的R5短肽的氨基酸序列進行密碼子優(yōu)化，獲得適合于大腸桿菌表達的R5短肽基因序列，并根據(jù)該基因序列設(shè)計引物。用primer F和primer R引物，以攜帶編碼馬來酸順反異構(gòu)酶基因的重組質(zhì)粒pET-24a-maiA[14]為模板，反向PCR擴增。將PCR產(chǎn)物用NdeⅠ酶切后自身連接，獲得重組質(zhì)粒pET-24a-R5-MaiA。重組質(zhì)粒用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳圖譜獲得5 300 bp和850 bp大小兩條帶；用NdeⅠ和HindⅢ分別單酶切，獲得6 150 bp一條帶 （圖1），表明R5肽段已經(jīng)成功插入，進一步經(jīng)DNA測序驗證表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-24a-R5-MaiA。

將重組質(zhì)粒pET-24a-R5-MaiA轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)誘導(dǎo)表達后，SDS-PAGE 電泳獲得分子量29 000 Da左右的電泳條帶，如圖2所示。

利用重組蛋白C端的His標(biāo)簽[14]，經(jīng)1 mL的His Trap FF crude鎳柱純化后 （SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖2），在40℃pH=8.0的條件下測定重組酶R5-MaiA的比酶活為42 U/mg與MaiA的比酶活（48 U/mg）相差不大，表明融合表達R5短肽對MaiA酶活性無顯著影響。

圖1 pET-24a-R5-MaiA質(zhì)粒酶切驗證電泳圖Fig.1 Identification of pET-24a-R5-MaiA by enzyme digestion

圖2R5-MaiA融合酶表達與純化SDS-PAGE圖譜Fig.2 Expression and purification of R5-MaiA in E.coli

2.2 融合馬來酸順反異構(gòu)酶固定化酶（Si-CLEAs）的制備

2.2.1 不同硫酸銨飽和度對融合酶（R5-MaiA）沉淀能力的影響 分別用不同體積分數(shù)的硫酸銨分級沉淀細胞破碎上清中的游離酶，從圖3可以看出，在0～20%，20%～40%兩個梯度的飽和硫酸銨體積分數(shù)下都有大量的R5-MaiA沉淀聚集；當(dāng)飽和硫酸銨濃度在40%～60%時沉淀聚集的蛋白質(zhì)中幾乎不再含有R5-MaiA，并且含有大量的雜蛋白；在60%～80%和80%～100%飽和硫酸銨體積分數(shù)下R5-MaiA和雜蛋白都很少有聚集沉淀。因此選擇40%的硫酸銨作為聚集沉淀的體積分數(shù)。

圖3 硫酸銨分級沉淀SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on R5-MaiA precipitation

2.2.2 交聯(lián)pH對R5-MaiA交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）酶活的影響 交聯(lián)pH對交聯(lián)酶聚集體CLEAs酶活的影響如圖4所示。在磷酸鹽緩沖液pH 7.5的時候CLEAs的酶活最高，這是因為R5-MaiA預(yù)測的等電點在7.5附近，在此pH條件下R5-MaiA沉淀較為完全，交聯(lián)反應(yīng)也較充分，所以交聯(lián)后酶活回收率也較高，因此選擇7.5作為交聯(lián)時的pH值[l1]。

圖4 交聯(lián)時pH對CLEAs酶活的影響Fig.4 Effect of cross-linking pH on the relative activity of CLEAs

2.2.3 交聯(lián)劑戊二醛的濃度對CLEAs酶活的影響交聯(lián)劑戊二醛的體積分數(shù)對CLEAs酶活的影響如圖5所示。低體積分數(shù)的戊二醛使得反應(yīng)液中的酶分子交聯(lián)程度低，部分游離酶損失且形成的交聯(lián)顆粒小導(dǎo)致酶活偏低；隨著戊二醛體積分數(shù)的增大，CLEAs的酶活回收率不斷增加，當(dāng)戊二醛體積分數(shù)增加到0.1%時CLEAs的酶活最高；繼續(xù)提高戊二醛的體積分數(shù)，過度的交聯(lián)，導(dǎo)致酶活回收率不斷下降。因此確定交聯(lián)時戊二醛的最佳添加體積分數(shù)為0.1%。

圖5 戊二醛體積分數(shù)對CLEAs酶活的影響Fig.5 Effect of concentration of glutaraldehyde on the relative activity of CLEAs

2.2.4 交聯(lián)時間對CLEAs酶活的影響 交聯(lián)時間對CLEAs酶活的影響如圖6所示。當(dāng)交聯(lián)時間小于1 h時，隨交聯(lián)時間的增加酶活保留逐漸增大，交聯(lián)時間過短不能使得酶分子充分交聯(lián)，離心沉淀后使得部分游離酶損失；當(dāng)交聯(lián)時間為1 h時，CLEAs的酶活保留達到最高值；當(dāng)交聯(lián)時間大于1 h后，隨著交聯(lián)時間的增加，酶活保留逐漸下降，這是由于交聯(lián)時間過長導(dǎo)致戊二醛與酶分子過分交聯(lián)，破壞了酶分子的構(gòu)象從而影響了酶活。因此，確定1 h為較適合的交聯(lián)時間。

圖6 交聯(lián)時間對CLEAs酶活的影響Fig.6 Effect of cross-linking time on the relative activity of CLEAs

在上述最優(yōu)硫酸銨沉淀條件和戊二醛交聯(lián)條件下制備CLEAs的基礎(chǔ)上，進一步利用正硅酸甲酯與R5肽段作用的特性，完成對CLEAs的包埋，即獲得固定化酶Si-CLEAs，并考察該固定化酶的性質(zhì)。

2.3 馬來酸順反異構(gòu)酶固定化酶Si-CLEAs的性質(zhì)

2.3.1 固定化酶最適酶促反應(yīng)溫度 圖7比較了游離酶與Si-CLEAs固定化酶的最適催化溫度，可見游離酶的最適酶促反應(yīng)溫度為40℃，而固定化酶的最適酶促反應(yīng)溫度為55℃。這是由于Si-CLEAs中酶分子是以共價鍵的形式連接在一起，使得CLEAs中的酶分子比游離酶的剛性更強，而在CLEAs外圍包埋的硅也進一步增加了傳熱阻力，因此酶促反應(yīng)的發(fā)生就需要更多的能量，才可以使酶分子活性中心與底物結(jié)合發(fā)揮催化作用。

圖7 固定化酶與游離酶最適反應(yīng)溫度Fig.7 Optimun reaction temperature of Si-CLEAs and R5-MaiA

2.3.2 固定化酶熱穩(wěn)定性 游離酶經(jīng)過固定化后熱穩(wěn)定性通常會有所提高[16]，實驗比較了游離酶和3種固定化酶在相同溫度下的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖8所示。隨著儲存時間的延長，游離酶和固定化酶的酶活性均呈現(xiàn)下降的趨勢，并且可以看出游離酶活性下降的速度要明顯比固定化酶快，游離酶在55℃下的半衰期為0.5 h，直接包埋的固定化酶Si-R5-MaiA和交聯(lián)酶聚集體CLEAs在55℃下的熱穩(wěn)定性均有提高，而固定化酶Si-CLEAs在55℃下的熱穩(wěn)定性最好，半衰期為4 h，因此，Si-CLEAs這種固定化方法有效提高了馬來酸順反異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 固定化酶最適酶促反應(yīng)pH 固定化酶的最適pH除與載體和產(chǎn)物性質(zhì)有關(guān)外，還會受到其他因素的影響。游離酶經(jīng)過固定化后其最適酶促反應(yīng)pH值通常發(fā)生變化，且很難預(yù)測。由圖9所示，在經(jīng)過固定化后，固定化酶的最適酶促反應(yīng)pH為7.3，與游離酶相比（最適反應(yīng)pH為8.0）略向酸性方向偏移。

圖8 3種固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的比較Fig.8 Stability of CLEAs，Si-R5-MaiA，Si-CLEAs and free R5-MaiA at 55℃

圖9 固定化酶與游離酶的最適反應(yīng)pHFig.9 Optimun pH of Si-CLEAs and R5-MaiA

2.3.4 固定化酶Si-CLEAs的重復(fù)使用性 固定化酶這一技術(shù)的主要目標(biāo)就是制備能夠重復(fù)多次使用的生物催化劑，所以固定化酶的操作穩(wěn)定性是評判固定化方法的一個重要指標(biāo)，并且能夠影響生產(chǎn)成本。對3種固定化酶 Si-CLEAs，Si-R5-MaiA，CLEAs進行操作穩(wěn)定性實驗，結(jié)果如圖10所示，Si-CLEAs在經(jīng)過8個批次的重復(fù)使用后依然保留78%的酶活，其酶活保留高于CLEAs和Si-R5-MaiA，固定化酶Si-CLEAs具有良好的重復(fù)使用性。

圖10 固定化酶的重復(fù)使用性Fig.10 Effect of reusability on relative activity of Si-R5-MaiA，CLEAs and Si-CLEAs

2.4 固定化酶Si-CLEAs在富馬酸合成中的應(yīng)用

進一步將馬來酸順反異構(gòu)酶固定化酶裝入填充床反應(yīng)器，以馬來酸為底物合成富馬酸，并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化。

2.4.1 停留時間對填充床反應(yīng)器生產(chǎn)富馬酸的影響停留時間是底物催化的一個重要參數(shù)，停留時間由泵入底物的流速和反應(yīng)器體積大小決定，本實驗通過調(diào)節(jié)底物的流速來控制停留時間。由圖11可知，富馬酸的轉(zhuǎn)化率隨停留時間的增加而增加，體積轉(zhuǎn)化速率隨時間的增加先增加后減少。低的停留時間雖然節(jié)約了時間但是不利于底物轉(zhuǎn)化，而高的停留時間則會導(dǎo)致生產(chǎn)周期長、增加生產(chǎn)成本。因此綜合考慮，選擇50 min作為最佳停留時間。

圖11 停留時間對填充床反應(yīng)器生產(chǎn)富馬酸的影響Fig.11 Effect of residence time on the production of fumarate in a packed-bed reactor

2.4.2 底物濃度對填充床反應(yīng)器生產(chǎn)富馬酸的影響 底物濃度對富馬酸生產(chǎn)的影響如圖12所示，在最佳停留時間下，轉(zhuǎn)化率隨底物濃度的增加而降低，體積轉(zhuǎn)化速率在較低濃度下很低，在中高濃度下體積轉(zhuǎn)化速率維持在較穩(wěn)定的水平；停留時間為50 min的條件下，此固定化酶填充床反應(yīng)器可完全轉(zhuǎn)化的最佳底物濃度為0.3 mol/L，此時填充床反應(yīng)器的催化效率最高。

圖12 底物濃度對填充床反應(yīng)器生產(chǎn)富馬酸的影響Fig.12 Effect of substrate concentration on the production of fumarate in a packed-bed reactor

2.4.3 填充床反應(yīng)器生產(chǎn)富馬酸的能力 在實際生產(chǎn)中，為保證富馬酸工業(yè)生產(chǎn)的需要，富馬酸的轉(zhuǎn)化率要保持在95%以上，根據(jù)填充床反應(yīng)器的操作穩(wěn)定性，需調(diào)節(jié)底物濃度和保留時間以達到工業(yè)生產(chǎn)富馬酸的需要，選擇最佳底物濃度為0.3 mol/L，初始轉(zhuǎn)化率為99%，在生產(chǎn)10個批次后，富馬酸轉(zhuǎn)化率依然保持在95%以上（圖13），表明固定化酶反應(yīng)器能較好的滿足工業(yè)化酶法生產(chǎn)富馬酸的需求。

圖13 填充床反應(yīng)器重復(fù)生產(chǎn)富馬酸的能力Fig.13 Reusability of Si-CLEAs in a packed-bed reactor for fumarate production

3 結(jié) 語

馬來酸順反異構(gòu)酶與R5肽端融合表達后，比酶活無顯著降低。以40%的硫酸銨作為沉淀劑，體積分數(shù)0.1%的戊二醛作為交聯(lián)劑制得的融合馬來酸順反異構(gòu)酶交聯(lián)酶聚集體CLEAs，在經(jīng)過自包埋處理之后形成固定化酶Si-CLEAs，其酶活回收率為60%。固定化酶的催化最適溫度為55℃比游離酶提高了15℃，有利于實現(xiàn)馬來酸順反異構(gòu)酶在極端條件下的催化應(yīng)用；在55℃條件下的半衰期由原來的0.5 h提高到4 h，其熱穩(wěn)定性有了明顯的提高；在分批進行8個批次的重復(fù)催化反應(yīng)后，保留了78%的初始酶活，顯示出良好的操作穩(wěn)定性。Si-CLEAs固定化酶裝入填充床反應(yīng)器以馬來酸為底物生產(chǎn)富馬酸，重復(fù)生產(chǎn)10個批次后，仍可保留95%的轉(zhuǎn)化率。該研究為應(yīng)用固定化酶Si-CLEAs工業(yè)化生產(chǎn)富馬酸提供了借鑒。