穴位貼敷聯合穴位注射烏體林斯對OVA哮喘模型大鼠氣道炎癥和氣道高反應的影響?

梁志娟，耿立梅

(1. 邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056000； 2. 河北省中醫院，石家莊 050011)

社會經濟發展日新月異，但環境污染和人口老齡化日益凸顯[1-2]，哮喘的發病率也明顯升高[3-5]。現代醫學認為，哮喘是以氣道慢性非特異性炎癥及氣道的高反應性為本質的一種異質性疾病，在臨床可分為急性發作期、慢性持續期和緩解期[6]。本實驗使用OVA誘導Wistar大鼠發生過敏性哮喘，該模型具有高嗜酸性粒細胞浸潤特征，在治療上采用中醫外治療法，即穴位貼敷和穴位注射，這種療法通過刺激體表穴位激發經氣，調動經脈的行氣血、營陰陽功能，以提高機體的免疫力防病治病，在減少哮喘反復發作方面取得了良好的療效。在過敏性哮喘患者的氣道中，Th2細胞以NF-κB依賴的方式釋放IL-4、IL-5等，這些細胞因子促進B淋巴細胞合成和分泌IgE，參與氣道炎癥反應。另外ET-1在肺臟中含量豐富，是一種強支氣管收縮劑，由上皮細胞合成95%以上的ET-1輸送至黏膜下層。本實驗通過建立OVA致敏的慢性持續期哮喘模型，檢測其血清IgE、肺組織NF-κB及其下游細胞因子、內皮素-1水平，探討穴位貼敷和穴位注射烏體林斯治療哮喘的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF 級雄性Wistar大鼠，體質量(120～140)g，購于河北醫科大學實驗動物中心(合格證編號1605283，許可證號SCXK(冀)2013-1-003)。適應性飼養1周后隨機分組為正常組、哮喘組、布地奈德霧化組、貼注組、聯合組各13只。

1.2 藥物、試劑及相關儀器

貼敷藥物粉末(白芥子、細辛、甘遂、延胡索、百部、五味子、前胡、麻黃)由河北省中醫院中藥房提供，草分枝桿菌F.u.36注射液(1.72 μg/1 ml成都金星健康藥業有限公司生產)，普米克令舒(1 mg、2 ml, Astrazeneca)，雞卵清蛋白(美國Sigma公司分裝，GradeⅡ)，自制透明霧化箱(60 cm×40 cm×30 cm)，NE502空氣壓縮式霧化器(深圳市金億帝科技有限公司)，大鼠IgE定量ELISA試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)，IL-4、IL-5放射免疫分析藥盒(北京華埠利特生物技術研究所)，碘[125I]內皮素放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業生物科技有限公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，MK3酶聯免疫檢測儀(芬蘭雷勃)；FJ-2021 γ-放射免疫計數器(西安二六二廠)；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(武漢同濟醫科大學)；DP73數碼顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 模型制備

采用腹腔注射OVA致敏后加連續霧化激發制作哮喘大鼠模型，治療期間給予間斷激發模擬慢性持續期。除正常對照組外，實驗第1、8天每只大鼠腹腔注射新鮮配制的10%卵蛋白1 ml(內含OVA100 mg，Al(OH)3100 mg)致敏。第16天時將造模大鼠放入不完全封閉的霧化吸入箱內開始激發，每次10只，用霧化器噴入含2%卵蛋白激發，每次20 min，每日1次，連續激發直至大鼠出現煩躁、咳嗽、呼吸加快、點頭呼吸、行動遲緩、口唇紫紺甚至腹肌痙攣等癥狀，取血可檢測到EOS升高,取肺組織HE染色觀察符合炎性改變，認為哮喘模型制造成功。

2.2 給藥

造模成功后開始治療，貼注組選取大椎穴、雙定喘穴、雙肺俞穴、雙腎俞穴，將貼敷藥物使用鮮姜汁調和后進行貼敷，選取雙定喘、雙肺俞穴交替使用烏體林斯穴位注射(穴位注射后不再貼敷藥物)，每周3次；布地奈德霧化組給予吸入用布地奈德霧化溶液霧化治療，每日1次(藥物用量參考徐叔云《藥理試驗方法學》[7]中人和動物用藥劑量換算)；聯合組采用貼敷并穴注、布地奈德霧化2種方法進行治療,共治療1個月共計12次。大鼠取穴參照華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》[8]，在穴位注射之前使用10%水合氯酸腹腔注射，使大鼠處于安定狀態。

2.3 標本取材

所有動物治療完畢后，在取標本當天再次給予霧化激發，觀察癥狀及體征并稱量體質量，10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g進行腹腔注射麻醉，仰面固定于解剖臺上，股動脈剪開放血3 ml/只，置于普通血清管中，隨后從腹壁正中線處剪開表皮及肌肉層，剪斷膈肌及兩側肋骨暴露胸腔內部器官，取右肺上葉置于凍存管中投入液氮備用檢測IL-4/5和ET-1，取右肺中葉生理鹽水漂洗去除血滯后放于10%甲醛溶液內固定24 h，以備制作蠟塊，后期行HE染色及免疫組化染色。隨即剝離左主支氣管，插入灌胃針，用0.9%生理鹽水分2次共注射進5 ml，行左肺肺泡灌洗，每次氣道內注入回抽3次，回收液體量>70%合格，BALF液和血清皆置于低溫冰箱中保存。

2.4 檢測指標

使用血細胞計數板計數BALF中總的細胞數以及中性、淋巴、嗜酸分類比例；經HE染色，鏡下觀察肺組織病理學改變并進行炎細胞浸潤評分；ELISA檢測血清總IgE,放射免疫法測定肺組織中ET-1、IL-4、IL-5水平；免疫組化染色后鏡下觀察肺組織NF-κBp65胞核陽性表達情況，顯微圖像分析系統分析IOD值。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 穴位貼敷聯合穴位注射法對BALF中細胞總數和分類計數的影響

表1顯示，模型組BALF中的細胞總數和分類計數(嗜酸、中性、淋巴)明顯高于正常組(P<0.05)；各治療組均低于哮喘組(P均<0.05)；聯合組低于布地奈德組和貼注組(P均<0.05)；布地奈德組低于貼注組(P<0.05)，表明穴位貼敷和穴位注射能降低氣道中炎細胞浸潤，但作用不如霧化吸入激素治療，聯合使用的作用最佳。

表1 BALF中細胞總數和分類計數

注：與正常組比較:aP<0.05;與哮喘組比較:bP<0.05; 與貼注組比較:cP<0.05; 與布地奈德組比較:dP<0.05

3.2 穴位貼敷聯合穴位注射對血清IgE水平的影響

表2顯示，與正常組比較，哮喘組IgE水平明顯增高，說明本實驗制作的哮喘模型具有過敏性哮喘所具有的高IgE特點，說明模型制造成功。各個治療組的血清IgE水平均降低(P均<0.01)，其中聯合治療組降低明顯。

表2 肺組織HE炎細胞浸潤評分[9]和免疫組化NF-κB陽性細胞

注：與正常組比較:aP<0.05;與哮喘組比較:bP<0.05; 與貼注組比較:cP<0.05; 與布地奈德組比較:dP<0.05

3.3 穴位貼敷聯合穴位注射對肺組織中IL-4、IL-5的影響

表3顯示，IL-4：哮喘組高于正常組(P<0.01),貼注組、布地奈德組、聯合組低于哮喘組(P<0.05),布地奈德組低于貼注組(P<0.05)，聯合組低于布地奈德組(P<0.05)。IL-5：哮喘組高于正常組(P<0.01)，貼注組、布地奈德組、聯合組低于哮喘組(P<0.05),布地奈德組低于貼注組(P<0.05)，聯合組低于布地奈德組(P<0.05)。

表3 肺組織中IL-4、IL-5、ET-1水平

注：與正常組比較:aP<0.05;與哮喘組比較:bP<0.05; 與貼注組比較:cP<0.05; 與布地奈德組比較:dP<0.05

3.4 肺組織ET-1水平

表3顯示，哮喘組肺組織ET-1水平高于正常組(P<0.01),貼注組、布地奈德組、聯合治療組肺組織ET-1水平均低于模型組(P均<0.01)；3個治療組之間比較，聯合組、布地奈德組較貼注組降低(P<0.01,P<0.05)，聯合組和布地奈德組兩者之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3.5 穴位貼敷聯合穴位注射對大鼠肺組織病理學改善情況

表2顯示，哮喘組肺組織病理炎細胞浸潤評分比正常組顯著增高(P<0.01)。3個治療組比哮喘組降低(P均<0.01)，其中聯合組改善最明顯。

圖1顯示，正常組的支氣管管腔光滑，氣道及周圍血管組織無明顯炎性細胞浸潤。哮喘組氣管壁纖毛紊亂并有脫落現象，氣道周圍炎性細胞浸潤，氣道和肺泡壁增厚，可見平滑肌收縮使氣道管管腔不規則。貼注組、布地奈德組、聯合組支氣管壁的變化、氣道平滑肌受損及炎性細胞浸潤程度相對較輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理比較(HE×400)注：正常組、哮喘組、貼注組、布地奈德霧化組、聯合組

3.6 穴位貼敷聯合穴位注射對肺組織NF-κBp65陽性細胞IOD表達及免疫組化NF-κBp65入核情況影響

表2顯示，哮喘組大鼠肺組織NF-κBp65陽性細胞IOD值高于正常組(P<0.01)，貼注組、布地奈德組、聯合組均低于模型組(P均<0.01)；聯合組肺組織NF-κBp65陽性細胞IOD值較貼注組、布地奈德組低(P<0.01)，布地奈德組低于貼注組(P<0.01)。

圖2顯示，細胞核染成黃色、棕黃色、棕色的細胞為NF-κBp65陽性細胞，表明NF-κB從胞漿進入胞核活化，可見正常組氣道上皮細胞有個別胞核陽性細胞，哮喘組胞核陽性細胞明顯可見，各治療組胞核陽性細胞減少，治療組中聯合組胞核陽性細胞最少。

圖2 NF-κB在氣道中的表達比較(免疫組化×400)注：正常組、哮喘組、貼注組、布地奈德霧化組、聯合組

4 討論

哮喘的慢性氣道炎癥是其基本特征之一，其中Th1/Th2失衡已被認為是哮喘發生的重要機制。在此過程中，Th2細胞通過分泌多種細胞因子參與致病，這些細胞因子進一步促進B淋巴細胞合成和分泌IgE，并與多種炎性細胞上的受體結合，參與炎癥反應，因此IgE升高是過敏性哮喘氣道炎癥的核心。而且多項研究提示，抗IgE治療藥物奧馬珠單抗在改善患者癥狀、減少急發事件和激素用量上取得很好成績[10-11]。另外，過敏性哮喘是發生在氣道的嗜酸性細胞聚集的典型過敏性疾病，EOS增多主要通過IL-5依賴和非IL-5依賴兩種機制，其中IL-4是非IL-5依賴機制中重要的炎癥因子之一。有研究顯示，阻斷IL-5后能夠使外周血和痰液中EOS浸潤減少[12-13]。在上述氣道的IgE增多和EOS浸潤導致過敏性哮喘發生機制的上游，是Th2細胞依賴NF-κB釋放細胞因子和炎性介質。哮喘患者NF-κB核定位、IκB(κB抑制蛋白)的磷酸化及IKK-β(κB激酶)在氣道中的表達量均增高[14]。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白以無活性的形式存在于細胞漿中，遇刺激后進入細胞核活化，調節基因轉錄。NF-κB調控Thl/Th2細胞因子相關基因表達的結果是使炎癥因子產生級聯放大，對機體免疫或炎癥反應的啟動及維持發揮重要作用。氣道高反應性是哮喘的另一個典型特征，肺是ET-1含量最豐富的器官，由上皮細胞合成的ET-1，95%以上輸送至黏膜下層。有研究提示，ET-1的特異性結合位點在氣道平滑肌最致密，ET-1也是強支氣管收縮劑，吸入ET-1后支氣管收縮效能大約是乙酰膽堿的100倍，所以ET-1是一種較強的支氣管平滑肌收縮劑[15]。

本研究表明，OVA誘導哮喘大鼠模型血清IgE、肺組織NF-κB及其下游細胞因子IL-4、IL-5、肺組織ET-1水平較正常組顯著增高，病理圖片及評分顯示炎癥改變明顯。經過干預后，治療組的各項指標較模型組均有降低，3治療組之間比較聯合治療組治療效果最明顯，貼注組和布地奈德霧化組兩者比較，布地奈德治療組效果明顯。但聯合組和布地奈德組兩者之間比較，ET-1水平差異無統計學意義，造成這種原因不排除存在穴位貼敷操作技術上的原因。總之，經過穴位貼敷和注射烏體林斯能夠改善氣道炎癥，其作用機制可能為抑制肺組織中NF-κB從胞漿進入胞核后的活化，從而降低其下游細胞因子IL-4、IL-5水平，進而阻斷這些下游細胞因子，促進B淋巴細胞產生IgE引起的炎癥反應；另外，穴位貼敷聯合穴位注射烏體林斯能夠降低氣道高反應性，其作用機制可能與抑制氣道上皮細胞產生過量的ET-1有關。