黃芪注射液對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠神經(jīng)功能及出血灶周圍炎性因子表達(dá)的影響?

梁 賦，胡少敏，黃 達(dá)，王興文，吳飛燕，馮清春，吳碧瑩，彭美娟，黃宏敏

(1. ?？谑械谌嗣襻t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, ?？?571100； 2. 海南省中醫(yī)院腦病科 ,?？?570203)

腦出血是常見的腦血管疾病，屬于非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，具有較高的發(fā)病率、致殘率，嚴(yán)重危害患者生命健康及生活質(zhì)量[1-2]。目前臨床治療腦出血的主要措施見于降顱內(nèi)壓、手術(shù)清除血腫、脫水等對癥支持治療，可有效緩解患者急性期臨床癥狀，但大多數(shù)患者仍會伴有不同程度的神經(jīng)損傷，因此尋求、開發(fā)新的、更有效的治療腦出血的藥物已成為目前研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腦出血發(fā)病主要與痰熱化水、陰虛風(fēng)動、心火熾盛、肝陽上亢、氣虛血瘀等導(dǎo)致絡(luò)破血溢有關(guān)，其中肝腎陰虛、氣血虧虛為致病之本，風(fēng)、痰、火、水、瘀為其致病之標(biāo)，故治療應(yīng)以活血、益氣、通腑、化痰、利水、息風(fēng)等為主[3-4]。劉廣輝等[5]研究報道，黃芪注射液具有補(bǔ)血益氣、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、通經(jīng)活絡(luò)、祛瘀除滯等功效，已用于臨床腦中風(fēng)、腦出血等疾病的治療，但有關(guān)其對腦出血患者出血灶組織中炎性因子的影響尚不多見。因此，本研究以黃芪注射液治療實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠，進(jìn)一步探究對出血灶周圍腦組織炎性因子表達(dá)的影響，分析其神經(jīng)功能保護(hù)作機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

74只清潔級健康雄性SD大鼠，8～12周齡，體質(zhì)量約250～300 g，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物合格證號SCXK(寧)2005-001)。

1.2 主要儀器與試劑

黃芪注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，10 mL/支，生產(chǎn)批號0906162)；肝素鈉注射液(天津生物化學(xué)制藥廠，生產(chǎn)批號51170202)；Ⅶ型膠原酶(美國Sigma公司，生產(chǎn)批號232-582-9)；兔抗白介素-10(IL-10)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；SN-3型動物腦立體定位儀(日本NARISHIGE公司)；SB98-WLJH1型微量進(jìn)樣器(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；K90型牙科臺式手鉆(上海齒科醫(yī)械廠)；HM-315型石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；BH2型多功能光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Q500圖文處理系統(tǒng)(德國Leica公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠模型制備

50只雄性SD大鼠參照大鼠腦立體定位圖譜[6]以Yang GL等[7]方法構(gòu)建腦出血模型，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后取俯臥位將大鼠固定于立體定位儀上，于頭部正中皮膚長約1 cm縱切口，切開并兩側(cè)剝離骨膜，暴露前囟調(diào)整立體定位儀，參照大鼠立體定位圖譜，將微量注射器套管剪短定位于前囟0.5 mm處，中線向右旁開3 mm，以牙科鉆鉆約1 mm的圓孔，穿透露骨但不傷及腦組織，暴露硬腦膜并充分止血，無菌操作以微量注射器沿針孔垂直進(jìn)針刺入尾狀核團(tuán)，深度約5 mm，緩慢注射0.5 U/μLⅦ型膠原酶及6.25 U/μL肝素混合液0.25 μL，留針10 min后緩慢退出，注意骨蠟封閉鉆孔，清理并縫合頭皮并以酒精消毒。術(shù)后據(jù)Berderson法[8]對大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分，大于1分為建模成功。

1.4 動物分組及處理

將48只建模成功大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和實(shí)驗(yàn)組各24只，另選取24只SD大鼠建模期間注射等量生理鹽水，其余操作均同模型組及實(shí)驗(yàn)組，并將24只作為假手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)組建模后腹腔注射8 mL/(kg·d)黃芪注射液，模型組和假手術(shù)組則腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)干預(yù)7 d。

1.5 Berderson法進(jìn)行大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

分別干預(yù)1、2、3、7 d隨機(jī)選取各組6只大鼠，按Berderson法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分，其中0分為無神經(jīng)功能缺損，1分為注射對側(cè)前爪不能伸直，2分為伴有轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，3分為行走時身體向?qū)?cè)傾倒，4分為無任何反應(yīng)且不能行走，分值越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.6 蘇木精-伊紅(HE)染色[9]觀察大鼠出血灶周圍組織炎性病變

分別于干預(yù)1、2、3、7 d隨機(jī)選取各組6只大鼠，以預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌注，固定后以腦組織上遺留的針孔為中心，采集大鼠腦組織，完整保留出血灶及其周圍腦組織，常規(guī)制備連續(xù)冠狀石蠟組織切片，厚約3 μm，取干預(yù)7 d時各組大鼠出血灶周圍腦組織進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠出血灶周圍腦組織炎性病變。

1.7 免疫組化法[10]檢測大鼠出血灶周圍組織炎性因子表達(dá)情況

取干預(yù)1、2、3、7 d時各組大鼠出血灶周圍腦組織石蠟切片，采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色，經(jīng)二甲苯透明、梯度酒精復(fù)水，以3%過氧化氫去離子水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加IL-10及TNF-α一抗及二抗，于光學(xué)顯微鏡下以DAB染色液進(jìn)行顯色，中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并以德國LeicaQ500圖文處理系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，以細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野，計(jì)數(shù)IL-10及TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪注射液對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響

表1顯示，假手術(shù)組大鼠無明顯神經(jīng)行為異常，干預(yù)1～7 d內(nèi)神經(jīng)行為學(xué)評分無顯著性變化(P>0.05)；模型組及實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)行為學(xué)評分為0～3.5分，且干預(yù)1～7 d內(nèi)均呈先升高后降低趨勢(P<0.05)，于干預(yù)2 d時達(dá)到高峰，且干預(yù)3、7 d實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)行為學(xué)評分均顯著低于模型組(P<0.05)。

2.2 黃芪注射液對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠出血灶周圍炎性病變的影響

圖1顯示，HE染色顯示，干預(yù)7 d時假手術(shù)組針道周圍見少量炎性細(xì)胞浸潤，以單核細(xì)胞為主；干預(yù)7 d時模型組可見明顯出血灶，炎性細(xì)胞浸潤明顯增加，以中性粒細(xì)胞為主；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多且組織水腫程度加重；干預(yù)7 d時實(shí)驗(yàn)組出血灶范圍縮小，炎性細(xì)胞浸潤較同期模型組顯著減輕，出血灶周圍腦組織水腫程度也減輕。

圖1 HE染色顯示干預(yù)7 d時各組出血灶周圍腦組織病理損傷(×200)注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.實(shí)驗(yàn)組

2.3 黃芪注射液對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠出血灶周圍腦組織炎性因子表達(dá)的影響

表2、3圖2顯示，干預(yù)1～7 d假手術(shù)組大鼠出血灶周圍腦組織IL-10及TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)量無顯著性變化(P>0.05)；而模型組及實(shí)驗(yàn)組出血灶周圍腦組織IL-10陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸降低(P<0.05)，且干預(yù)2、3、7 d實(shí)驗(yàn)組IL-10陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組，干預(yù)1、2、3、7 d實(shí)驗(yàn)組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對照組(P<0.05)。

圖2 免疫組化觀察干預(yù)7 d時各組大鼠出血灶周圍腦組織IL-10及TNF-α表達(dá)情況(×400)注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.實(shí)驗(yàn)組

表1 黃芪注射液對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及出血灶周圍腦組織IL-10、TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)量的影響

注：與假手術(shù)組比較:*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

腦出血患者一般伴有不同程度的腦水腫及出血灶周圍腦細(xì)胞損傷，導(dǎo)致其病情惡化，伴發(fā)嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損。目前對于腦出血后腦水腫及腦細(xì)胞損傷的發(fā)生機(jī)理尚不明確，可能與出血灶機(jī)械性壓迫周圍腦組織、出血灶周圍炎性反應(yīng)及局部腦組織缺血缺氧等密切相關(guān)[11]。

中醫(yī)認(rèn)為腦出血屬于“中風(fēng)”范疇，其基本病機(jī)為肝陽上亢，陽升風(fēng)動，風(fēng)火上擾，氣血逆亂犯腦，導(dǎo)致絡(luò)破血溢、血溢于脈外而留于腦竅則成瘀?！吨嗅t(yī)病證療效診斷標(biāo)準(zhǔn)》[12]記載：“中風(fēng)主要是由于氣血逆亂，導(dǎo)致腦脈閉阻或血溢腦脈”，并以半身不遂、肢體麻木、昏仆、舌蹇為主要臨床表現(xiàn)，屬于腦血管病范疇[13]。中醫(yī)藥在治療腦出血方面具有毒副作用小、價格低廉等優(yōu)勢。本研究所用黃芪是豆科紫云英屬膜莢黃芪或蒙古黃芪的根，黃芪注射液具有活血化瘀、利水消腫、扶正固本、通經(jīng)活絡(luò)、脫毒生肌等功效，是臨床常用的補(bǔ)氣益氣中藥[14]。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣血是腦生長發(fā)育和產(chǎn)生各種功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，氣血失衡是腦血管病發(fā)病的主要病機(jī)。黃芪是補(bǔ)血益氣之要藥，對修復(fù)腦組織損傷效果確切，但目前黃芪注射液對神經(jīng)組織保護(hù)作用的機(jī)制研究尚不多見。黃芪注射液主要活性成分包括黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮及其類似物等，富含大量微量元素及氨基酸。韓金利等[15]研究報道，黃芪皂苷可通過提高缺血腦組織谷胱甘肽表達(dá)量，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及自由基生成，繼而減輕腦組織細(xì)胞損傷，恢復(fù)缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞生理功能。本研究中腦缺血大鼠伴有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，經(jīng)黃芪注射液干預(yù)后3、7 d實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)行為學(xué)評分均顯著低于模型組，提示黃芪注射液對腦出血大鼠具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。研究[16]報道，出血灶周圍炎性損傷主要是由于中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、大量炎性因子異常表達(dá)等，引發(fā)腦出血灶周圍腦組織伴有嚴(yán)重病理損傷，而黃芪注射液具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗內(nèi)毒素及抗氧化損傷、抗炎、清除自由基等作用。本研究中HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)組出血灶范圍較模型組顯著縮小，炎性細(xì)胞浸潤程度及出血灶周圍腦組織水腫程度均明顯減輕，提示黃芪注射液可有效緩解腦出血大鼠出血灶周圍腦組織病理損傷。

出血灶周圍組織的缺血缺氧、組織水腫、氧化應(yīng)激反應(yīng)及各種炎性因子刺激、血流灌注改變等均可導(dǎo)致出血灶周圍組織的繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致腦出血后病情的進(jìn)一步惡化。且臨床研究[17]證實(shí)，腦出血后腦組織內(nèi)存在中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤、小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子參與的炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)是腦出血繼發(fā)性損傷形成的重要因素，因此調(diào)控炎性因子表達(dá)對抑制出血灶周圍炎性反應(yīng)至關(guān)重要。IL-10是重要的炎性細(xì)胞因子抑制因子，在腦組織可通過抑制TNF-α、IL-1等促炎因子的表達(dá)，并上調(diào)炎性細(xì)胞因子拮抗劑表達(dá)，抑制核因子-κB(NF-κB)通路活化，發(fā)揮抗炎效應(yīng)；TNF-α是一種多效性促炎因子，其在觸發(fā)炎性反應(yīng)及神經(jīng)損傷的過程中處于中心地位。且研究[18]報道，腦出血動物模型血腫內(nèi)及血腫周圍浸潤性白細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會釋放大量的TNF-α。王登科等[19]研究報道，黃芪注射液可有效擴(kuò)張血管，改善出血在周圍微循環(huán)，清除氧自由基繼而減輕出血灶周圍腦組織炎性損傷；還可通過免疫調(diào)節(jié)調(diào)控炎性因子IL-10及TNF-α等炎性因子的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，黃芪注射液可有效上調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠出血灶周圍腦組織抗炎因子IL-10表達(dá)及抑炎因子TNF-α表達(dá)，繼而緩解炎性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。但也有研究[20]顯示，黃芪注射液可通過抑制出血灶周圍腦組織細(xì)胞凋亡達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用，因而有關(guān)其神經(jīng)功能保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。

綜上，黃芪注射液可顯著改善實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠神經(jīng)功能，并可有效調(diào)節(jié)其出血灶周圍腦組織炎性因子IL-10及TNF-α表達(dá)水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，但有關(guān)其神經(jīng)保護(hù)的其他作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。