黃芪注射液對實驗性腦出血大鼠神經功能及出血灶周圍炎性因子表達的影響?

梁 賦，胡少敏，黃 達，王興文，吳飛燕，馮清春，吳碧瑩，彭美娟，黃宏敏

(1. 海口市第三人民醫院神經內科, 海口 571100； 2. 海南省中醫院腦病科 ,海口 570203)

腦出血是常見的腦血管疾病，屬于非外傷性腦實質內出血，具有較高的發病率、致殘率，嚴重危害患者生命健康及生活質量[1-2]。目前臨床治療腦出血的主要措施見于降顱內壓、手術清除血腫、脫水等對癥支持治療，可有效緩解患者急性期臨床癥狀，但大多數患者仍會伴有不同程度的神經損傷，因此尋求、開發新的、更有效的治療腦出血的藥物已成為目前研究的熱點。中醫學理論認為，腦出血發病主要與痰熱化水、陰虛風動、心火熾盛、肝陽上亢、氣虛血瘀等導致絡破血溢有關，其中肝腎陰虛、氣血虧虛為致病之本，風、痰、火、水、瘀為其致病之標，故治療應以活血、益氣、通腑、化痰、利水、息風等為主[3-4]。劉廣輝等[5]研究報道，黃芪注射液具有補血益氣、扶正祛邪、養心通脈、通經活絡、祛瘀除滯等功效，已用于臨床腦中風、腦出血等疾病的治療，但有關其對腦出血患者出血灶組織中炎性因子的影響尚不多見。因此，本研究以黃芪注射液治療實驗性腦出血大鼠，進一步探究對出血灶周圍腦組織炎性因子表達的影響，分析其神經功能保護作機制，為其臨床應用提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

74只清潔級健康雄性SD大鼠，8～12周齡，體質量約250～300 g，購于寧夏醫科大學實驗動物中心(動物合格證號SCXK(寧)2005-001)。

1.2 主要儀器與試劑

黃芪注射液(正大青春寶藥業有限公司，10 mL/支，生產批號0906162)；肝素鈉注射液(天津生物化學制藥廠，生產批號51170202)；Ⅶ型膠原酶(美國Sigma公司，生產批號232-582-9)；兔抗白介素-10(IL-10)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；SN-3型動物腦立體定位儀(日本NARISHIGE公司)；SB98-WLJH1型微量進樣器(北京中西遠大科技有限公司)；K90型牙科臺式手鉆(上海齒科醫械廠)；HM-315型石蠟切片機(德國Leica公司)；BH2型多功能光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Q500圖文處理系統(德國Leica公司)等。

1.3 實驗性腦出血大鼠模型制備

50只雄性SD大鼠參照大鼠腦立體定位圖譜[6]以Yang GL等[7]方法構建腦出血模型，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后取俯臥位將大鼠固定于立體定位儀上，于頭部正中皮膚長約1 cm縱切口，切開并兩側剝離骨膜，暴露前囟調整立體定位儀，參照大鼠立體定位圖譜，將微量注射器套管剪短定位于前囟0.5 mm處，中線向右旁開3 mm，以牙科鉆鉆約1 mm的圓孔，穿透露骨但不傷及腦組織，暴露硬腦膜并充分止血，無菌操作以微量注射器沿針孔垂直進針刺入尾狀核團，深度約5 mm，緩慢注射0.5 U/μLⅦ型膠原酶及6.25 U/μL肝素混合液0.25 μL，留針10 min后緩慢退出，注意骨蠟封閉鉆孔，清理并縫合頭皮并以酒精消毒。術后據Berderson法[8]對大鼠神經行為學進行評分，大于1分為建模成功。

1.4 動物分組及處理

將48只建模成功大鼠按隨機數字表法分為模型組和實驗組各24只，另選取24只SD大鼠建模期間注射等量生理鹽水，其余操作均同模型組及實驗組，并將24只作為假手術組。實驗組建模后腹腔注射8 mL/(kg·d)黃芪注射液，模型組和假手術組則腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，連續干預7 d。

1.5 Berderson法進行大鼠神經行為學評分

分別干預1、2、3、7 d隨機選取各組6只大鼠，按Berderson法進行神經行為學評分，其中0分為無神經功能缺損，1分為注射對側前爪不能伸直，2分為伴有轉圈現象，3分為行走時身體向對側傾倒，4分為無任何反應且不能行走，分值越高表明神經功能缺損越嚴重。

1.6 蘇木精-伊紅(HE)染色[9]觀察大鼠出血灶周圍組織炎性病變

分別于干預1、2、3、7 d隨機選取各組6只大鼠，以預冷的4%多聚甲醛溶液進行心臟灌注，固定后以腦組織上遺留的針孔為中心，采集大鼠腦組織，完整保留出血灶及其周圍腦組織，常規制備連續冠狀石蠟組織切片，厚約3 μm，取干預7 d時各組大鼠出血灶周圍腦組織進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠出血灶周圍腦組織炎性病變。

1.7 免疫組化法[10]檢測大鼠出血灶周圍組織炎性因子表達情況

取干預1、2、3、7 d時各組大鼠出血灶周圍腦組織石蠟切片，采用SABC法進行免疫組化染色，經二甲苯透明、梯度酒精復水，以3%過氧化氫去離子水封閉內源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加IL-10及TNF-α一抗及二抗，于光學顯微鏡下以DAB染色液進行顯色，中性樹膠封片后，于光學顯微鏡下觀察染色結果，并以德國LeicaQ500圖文處理系統進行結果統計，以細胞質中呈棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，計數IL-10及TNF-α陽性細胞數量。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 黃芪注射液對實驗性腦出血大鼠神經功能的影響

表1顯示，假手術組大鼠無明顯神經行為異常，干預1～7 d內神經行為學評分無顯著性變化(P>0.05)；模型組及實驗組神經行為學評分為0～3.5分，且干預1～7 d內均呈先升高后降低趨勢(P<0.05)，于干預2 d時達到高峰，且干預3、7 d實驗組神經行為學評分均顯著低于模型組(P<0.05)。

2.2 黃芪注射液對實驗性腦出血大鼠出血灶周圍炎性病變的影響

圖1顯示，HE染色顯示，干預7 d時假手術組針道周圍見少量炎性細胞浸潤，以單核細胞為主；干預7 d時模型組可見明顯出血灶，炎性細胞浸潤明顯增加，以中性粒細胞為主；神經膠質細胞明顯增多且組織水腫程度加重；干預7 d時實驗組出血灶范圍縮小，炎性細胞浸潤較同期模型組顯著減輕，出血灶周圍腦組織水腫程度也減輕。

圖1 HE染色顯示干預7 d時各組出血灶周圍腦組織病理損傷(×200)注：A.假手術組；B.模型組；C.實驗組

2.3 黃芪注射液對實驗性腦出血大鼠出血灶周圍腦組織炎性因子表達的影響

表2、3圖2顯示，干預1～7 d假手術組大鼠出血灶周圍腦組織IL-10及TNF-α陽性細胞數量無顯著性變化(P>0.05)；而模型組及實驗組出血灶周圍腦組織IL-10陽性細胞數量逐漸升高，TNF-α陽性細胞數量逐漸降低(P<0.05)，且干預2、3、7 d實驗組IL-10陽性細胞數量均顯著高于對照組，干預1、2、3、7 d實驗組TNF-α陽性細胞數量均顯著低于對照組(P<0.05)。

圖2 免疫組化觀察干預7 d時各組大鼠出血灶周圍腦組織IL-10及TNF-α表達情況(×400)注：A.假手術組；B.模型組；C.實驗組

表1 黃芪注射液對實驗性腦出血大鼠神經行為學評分及出血灶周圍腦組織IL-10、TNF-α陽性細胞數量的影響

注：與假手術組比較:*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

腦出血患者一般伴有不同程度的腦水腫及出血灶周圍腦細胞損傷，導致其病情惡化，伴發嚴重神經功能缺損。目前對于腦出血后腦水腫及腦細胞損傷的發生機理尚不明確，可能與出血灶機械性壓迫周圍腦組織、出血灶周圍炎性反應及局部腦組織缺血缺氧等密切相關[11]。

中醫認為腦出血屬于“中風”范疇，其基本病機為肝陽上亢，陽升風動，風火上擾，氣血逆亂犯腦，導致絡破血溢、血溢于脈外而留于腦竅則成瘀。《中醫病證療效診斷標準》[12]記載：“中風主要是由于氣血逆亂，導致腦脈閉阻或血溢腦脈”，并以半身不遂、肢體麻木、昏仆、舌蹇為主要臨床表現，屬于腦血管病范疇[13]。中醫藥在治療腦出血方面具有毒副作用小、價格低廉等優勢。本研究所用黃芪是豆科紫云英屬膜莢黃芪或蒙古黃芪的根，黃芪注射液具有活血化瘀、利水消腫、扶正固本、通經活絡、脫毒生肌等功效，是臨床常用的補氣益氣中藥[14]。中醫理論認為，氣血是腦生長發育和產生各種功能的物質基礎，氣血失衡是腦血管病發病的主要病機。黃芪是補血益氣之要藥，對修復腦組織損傷效果確切，但目前黃芪注射液對神經組織保護作用的機制研究尚不多見。黃芪注射液主要活性成分包括黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮及其類似物等，富含大量微量元素及氨基酸。韓金利等[15]研究報道，黃芪皂苷可通過提高缺血腦組織谷胱甘肽表達量，抑制脂質過氧化反應及自由基生成，繼而減輕腦組織細胞損傷，恢復缺血腦組織神經細胞生理功能。本研究中腦缺血大鼠伴有嚴重的神經功能障礙，經黃芪注射液干預后3、7 d實驗組神經行為學評分均顯著低于模型組，提示黃芪注射液對腦出血大鼠具有顯著的神經保護作用。研究[16]報道，出血灶周圍炎性損傷主要是由于中性粒細胞及巨噬細胞浸潤、小膠質細胞激活、大量炎性因子異常表達等，引發腦出血灶周圍腦組織伴有嚴重病理損傷，而黃芪注射液具有調節機體免疫、抗內毒素及抗氧化損傷、抗炎、清除自由基等作用。本研究中HE染色顯示，實驗組出血灶范圍較模型組顯著縮小，炎性細胞浸潤程度及出血灶周圍腦組織水腫程度均明顯減輕，提示黃芪注射液可有效緩解腦出血大鼠出血灶周圍腦組織病理損傷。

出血灶周圍組織的缺血缺氧、組織水腫、氧化應激反應及各種炎性因子刺激、血流灌注改變等均可導致出血灶周圍組織的繼發性損傷，導致腦出血后病情的進一步惡化。且臨床研究[17]證實，腦出血后腦組織內存在中性粒細胞及巨噬細胞浸潤、小膠質細胞激活及炎性因子參與的炎性反應，炎性反應是腦出血繼發性損傷形成的重要因素，因此調控炎性因子表達對抑制出血灶周圍炎性反應至關重要。IL-10是重要的炎性細胞因子抑制因子，在腦組織可通過抑制TNF-α、IL-1等促炎因子的表達，并上調炎性細胞因子拮抗劑表達，抑制核因子-κB(NF-κB)通路活化，發揮抗炎效應；TNF-α是一種多效性促炎因子，其在觸發炎性反應及神經損傷的過程中處于中心地位。且研究[18]報道，腦出血動物模型血腫內及血腫周圍浸潤性白細胞和活化的小膠質細胞會釋放大量的TNF-α。王登科等[19]研究報道，黃芪注射液可有效擴張血管，改善出血在周圍微循環，清除氧自由基繼而減輕出血灶周圍腦組織炎性損傷；還可通過免疫調節調控炎性因子IL-10及TNF-α等炎性因子的表達。本研究結果顯示，黃芪注射液可有效上調實驗性腦出血大鼠出血灶周圍腦組織抗炎因子IL-10表達及抑炎因子TNF-α表達，繼而緩解炎性損傷，促進神經功能恢復。但也有研究[20]顯示，黃芪注射液可通過抑制出血灶周圍腦組織細胞凋亡達到神經保護作用，因而有關其神經功能保護機制仍需進一步的系統研究。

綜上，黃芪注射液可顯著改善實驗性腦出血大鼠神經功能，并可有效調節其出血灶周圍腦組織炎性因子IL-10及TNF-α表達水平，發揮神經保護功能，但有關其神經保護的其他作用機制仍需進一步深入研究。