新活絡效靈丹對ApoE基因敲除早期動脈粥樣硬化小鼠Cav-1、SR-BI的影響?

耿 濤，房玉濤，張 云，劉桂芳

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport，RCT)是血脂代謝的關鍵環節，其能力的強弱決定著動脈粥樣硬化的進程與轉歸。B族I型清道夫受體(B scavenger receptor family of type I，SR-BI)、小凹蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)作為重要的脂質轉運體在RCT起始步驟中起重要作用[1-2]。

本研究通過ApoE基因敲除小鼠AS模型，觀察新活絡效靈丹對ApoE基因敲除小鼠早期AS的斑塊面積和斑塊/管腔面積比值(PA/ALA)的影響，并采用PCR技術，檢測主動脈內Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA 的表達水平，從而探討其抗AS早期斑塊的可能作用機制。

1 材料與方法[3-4]

1.1 實驗動物

6～8周齡ApoE基因敲除雄性小鼠(C57BL/6 J)45只，體質量(17～21) g，給予高脂飼料喂養；6～8周齡清潔級C57BL/6 J雄性小鼠10只，體質量(17～21) g，普通飼料喂養。飼養條件為2級，光照時間7∶00～19∶00，相對濕度40%～60%，室溫20～24 ℃，均購自北京大學醫學部實驗動物中心(許可證號SCXK(京)2011-0012)。

1.2 實驗藥物及制備

新活絡效靈丹組成(顆粒劑型)：丹參30 g，制乳香12 g，制沒藥12 g，三七4 g，由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司生產，中國中醫科學院廣安門醫院藥劑科制備。阿托伐他汀鈣片(立普妥)為大連輝瑞制藥有限公司提供，20 mg/片(批號031711k)。

1.3 主要儀器和試劑

光學顯微鏡(BX-41型，日本OLYMPUS公司)；切片機(日本SAKURA，型號CRM-440)；7900HT型熒光定量PCR儀(購自美國應用生物公司)；Trizol試劑(批號14105，購自Invitrogen公司)；Fermentas K1622 RT逆轉錄試劑盒(批號00044977,購自MBI公司)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(批號1108401,購自美國應用生物公司)；引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

引物序列：SR-B1,上游引物5’- ACCTTCAATGACAACGACACC-3’，下游引物5’-VVAVAGGATCTCACCAACTGT-3’，擴增物長度234 bp；Cav-1，上游引物5’- TCTACAAGCCCAACAACAAGG-3’，下游引物5’-GACAACAAGCGGTAAAACCAA-3’，擴增物長度241 bp。圖像分析軟件Image-Pro Plus Version 5.0 (Ipp5.0)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及造模 適應性喂養4 d，然后采用隨機數字表法將45只ApoE基因敲除小鼠分為模型組、西藥組、中藥組各15只，3組均喂以高脂飼料(78.85%基礎飼料+0.15%膽固醇+21%脂肪混合而成)13周。另設C57BL/6 J小鼠 10只為空白對照組，給予普通飼料喂養。

1.4.2 各組小鼠給藥方法 根據成人臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質量折算系數10折算成小鼠用量，造模同時即給予藥物干預，中藥組飼以新活絡效靈丹顆粒劑9.67 g/(kg·d)灌胃，西藥組飼以阿托伐他汀鈣片3.33 mg/(kg·d)。中藥組和西藥組藥物均以蒸餾水溶解后按體質量比灌胃，模型組按體質量比以生理鹽水灌胃，連續給藥13周，空白對照組小鼠則不予以處理。

1.5 觀察指標與方法

取材前夜禁食水。處死全部小鼠，無菌條件下取出主動脈根部。(1)部分組織常規石蠟包埋切片，自主動脈根部連心肌部分橫斷面進行連續切片(厚度5um)[5]。對切片進行HE染色，倒置顯微鏡下觀察主動脈橫切面組織學改變、AS病變程度，×15倍鏡下應用IPP5.0圖像分析軟件測量各組ApoE基因敲除小鼠內彈力膜圍繞面積(internal elastic laminal area IELA，μm2)、動脈管腔面積(artery lumen area，ALA, μm2)，計算斑塊面積、斑塊/管腔面積比值[6]。公式如下[2]：斑塊面積(plaque aera，PA，μm2)=IELA-ALA，斑塊/管腔面積比=PA/ALA。(2) 部分組織置于凍存管內液氮驟冷保存。采用RT-PCR 法檢測小鼠主動脈中SR-BImRNA、Cav-1mRNA表達，具體步驟參照試劑盒說明進行操作。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠主動脈組織HE染色結果

圖1顯示，空白對照組(A):主動脈內膜光滑連續，內皮細胞排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞；模型組(B)：主動脈內形成明顯的AS斑塊，并可出現脂質核心，膽固醇和膽固醇酯沉積，泡沫細胞增多，大量的巨噬細胞浸潤；西藥組(C)：管壁可見AS斑塊，斑塊面積明顯小于模型組；中藥組組(D)：斑塊面積顯著減少，部分內膜較為光滑。

圖1 各組小鼠主動脈根部組織病理比較(HE染色×15)注：圖1B.模型組小鼠主動脈根部組織病理圖，箭頭所指為AS斑塊，且出現明顯脂質核心，周圍大量巨噬細胞的浸潤；圖1 C為西藥組小鼠主動脈根部組織病理圖中箭頭所指同樣為 AS斑塊，但斑塊面積明顯小于模型組

2.2 各組小鼠主動脈斑塊面積、斑塊/管腔面積比值(PA/ALA)結果及主動脈Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表達比較

表1顯示，IPP5.0圖像分析軟件測量計算各組ApoE基因敲除小鼠主動脈切片的斑塊面積及PA/ALA后，結果顯示空白組主動脈內膜光滑連續，未見斑塊。模型組斑塊面積明顯增大，與模型組比較，西藥組斑塊面積顯著縮小(P<0.01), PA/ALA顯著降低(P<0.01)；中藥組與模型組比較，斑塊面積、PA/ALA均有顯著改變(P<0.01)；西藥組與中藥組比較，斑塊面積、PA/ALA差異無統計學意義(P>0.05)。模型組小鼠主動脈組織中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表達水平低于空白組(P<0.05)；西藥組小鼠主動脈組織中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表達水平高于模型組 (P<0.05)；中藥組小鼠主動脈組織中SR-BI mRNA、Cav-1 mRNA表達水平明顯高于模型組(P<0.01)；中藥組SR-BI mRNA表達水平高于西藥組，西藥組Cav-1 mRNA表達水平高于中藥組，但2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 新活絡效靈丹對各組小鼠斑塊面積、斑塊/管腔面積比值(PA/ALA)的影響及各組小鼠主動脈組織中Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表達比較

注：與空白對照組比較：*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

AS是心腦血管疾病的主要致病基礎，具有進展性和全身性的特點,也是一個穩定期與不穩定期交替的過程[7]。防治AS的關鍵在于能否進行早期干預，延緩斑塊形成和穩定斑塊。到目前為止，他汀是AS藥物治療的基石,但其肝功能受損、肌毒性、糖尿病風險增加、老年人記憶力減低等問題無法回避[8-12]。近年來，膽固醇逆向轉運逐漸成為抗動脈粥樣硬化的研究熱點，其初始過程是以通過Cav-1、SR-BI等多種蛋白參與，使細胞內膽固醇外流，從而有利于機體排出多余的膽固醇[13]。因此，藥物干預RCT對于AS的治療具有重要意義。

小凹(Caveolae) 是細胞膜上存在的一種特異性凹陷結構，直徑50～100 nm，是細胞內膽固醇的主要流出部位，在調節細胞內膽固醇以及維持細胞內膽固醇的動態平衡方面有重要影響[14]。小凹蛋白(Caveolin)是構成小凹的標志性核心蛋白，Cav-1是小凹蛋白中分布最為廣泛、高親和力的脂質結合蛋白，是形成細胞膜Caveolae結構的主要分子基礎[15]。其通過激活蛋白激酶信號通路促進血管新生，改善局部缺血情況[16-17]。最新研究證實，Cav-1對動脈粥樣硬化具有抑制作用，不僅體現在對平滑肌細胞增殖、轉移的抑制、巨噬細胞凋亡的誘導、凋亡細胞的清除之外，還與降低炎癥反應、穩定斑塊緊密相關[18]。脂質能增強炎癥反應，而炎癥又促進脂質沉積，二者相互影響加速AS的發生和發展。Cav-1能調節炎癥細胞和內皮細胞中信號傳導通路，進而影響炎癥反應過程[19-20]。既往研究表明，小凹及小凹蛋白1是膽固醇逆向轉運和炎癥應答的共同分子平臺，在調節細胞內膽固醇的動態平衡方面起重要作用[21-22]。

B型I類SR(SR-BI)屬于CD超家族，是一種CD36相關蛋白。1996年Acton等首次證實，SR-BI為可選擇性介導膽固醇吸收的高密度脂蛋白(high density lipoproteins，HDL)受體[23]，能介導膽固醇和膽固醇酯自HDL顆粒的轉運，并與HDL一起對于動脈粥樣硬化性心血管疾病的發生起保護作用[24-25]。通過SR-BI基因敲除大鼠的實驗，驗證了SR-BI在膽固醇的選擇性吸收、運輸及控制血漿膽固醇水平中的決定性作用[26]。

活血化瘀中藥防治AS的臨床療效已得到確認[27]，但不同種類的活血化瘀藥在抗AS中作用靶點有何不同，在各個階段中有何各自特點和優勢，尚缺乏深入研究。故挖掘簡便效廉、機理明確、早期干預作用突出的抗AS活血化瘀方劑，有著非常重要的現實意義。

活絡效靈丹(制乳香、制沒藥、當歸、丹參)出自張錫純所著《醫學衷中參西錄》。近年，此方對動脈粥樣硬化與心腦血管疾病的治療作用日益受到關注[28]。樹脂類活血化瘀中藥乳香、沒藥均能宣通氣血、透達臟腑經絡，現代研究表明，乳香具有抗氧化、抗炎、降脂等藥理活性，其抗炎作用與對炎癥細胞因子的調控和對蛋白激酶通路的影響有關[29-30]。沒藥其活性成分能降低炎癥介質過氧化物酶的活性[31]，具有強效抑制急慢性炎癥的作用。新方以三七易當歸活血益氣，制約乳香、沒藥久服耗氣之弊，從而達到養血不留瘀、祛瘀不傷正的目的。現代研究表明，三七有效組分三七總皂苷在提高心肌對缺氧環境耐受力的同時，還具有擴張血管、改善血供、增強免疫[32]的作用。丹參具有活血祛瘀、養血安神之功，現代研究表明，丹參可抗血小板聚集、降低血液黏稠度、改善微循環、擴張冠狀動脈、持續降低心肌耗氧、防止心肌缺血和心梗的發生，其有效組分丹參酮可降低炎癥細胞活性，抑制炎癥因子和趨化因子表達，抗氧自由基損害，降低缺血組織的再灌注損傷[33]。4藥配伍具有活血化瘀、益氣通絡之功，臨床治療動脈粥樣硬化療效顯著，但具體作用機制尚需進一步闡明。

本研究結果顯示，與模型組比較，中藥組和阿托伐他汀鈣組動脈粥樣硬化斑塊面積明顯縮小，2組均具有延緩動脈粥樣硬化早期斑塊形成的作用。中藥組動脈粥樣硬化小鼠主動脈組織Cav-1 mRNA、SR-BI mRNA表達提示明顯升高，與模型組比較差異明顯，提示新活絡效靈丹具有提高動脈粥樣硬化小鼠主動脈組織Cav-1 mRNA、SR-BI m RNA的表達作用，從而提高細胞內膽固醇流出的能力，推測為防治AS早期斑塊形成的機制之一。