β-Catenin蛋白和Survivin蛋白在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義

曾 珍 陳文添 戴艷枝

（1.江西省贛州市尋烏縣人民醫(yī)院病理科，江西贛州 342200；2.江西省贛州市尋烏縣人民醫(yī)院內(nèi)1科，江西贛州 342200；3.江西省人民醫(yī)院病理科，江西南昌 330006）

結(jié)直腸癌（CRC）是世界第3大流行性腫瘤，2015年的中國惡性腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在全部惡性腫瘤中均位居前5位[1]。美國癌癥協(xié)會預(yù)測，2018年其新發(fā)人數(shù)和死亡人數(shù)在男女性中均居第3[2]。其發(fā)病率在我國乃至世界范圍內(nèi)逐年上升，除與動物蛋白在人們飲食結(jié)構(gòu)中比重的增加，還與抑癌基因以及癌基因的改變密切相關(guān)[3]。在近幾年當中，人們對結(jié)直腸癌與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細胞凋亡機制異常之間的相關(guān)性進行了進一步研究，如：（1）Survivin基因為凋亡抑制蛋白家族中的一個新成員，于細胞分裂周期G2/M 期中呈現(xiàn)出高表達的情況，具有抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞有絲分裂以及促進細胞增殖的作用，通過對該基因的表達進行有效地抑制，能夠加快腫瘤細胞凋亡的速度，其基因突變都與結(jié)直腸癌等多種腫瘤有關(guān)。（2）Wnt/β-catenin信號通路能夠?qū)毎姆只c增值進行調(diào)節(jié)，而β-catenin則是該通路的一個重要調(diào)節(jié)因子。本實驗應(yīng)用免疫組化法檢測β-catenin蛋白和survivin蛋白在結(jié)直腸癌的表達情況并分析兩者表達的相關(guān)性，研究這兩種蛋白和結(jié)直腸癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2013年6月至 2017 年6月本院病理科保存的60例結(jié)直腸癌病理組織標本作為研究對象，患者術(shù)前未進行抗腫瘤治療，有完整的臨床資料。男性36例、女性24 例；年齡 32 ～ 86歲，平均年齡62歲；腫瘤直徑＞5 cm的32例，直徑＜5 cm的28例；高分化腺癌12 例，中分化腺癌 34例，低分化腺癌 14例；根據(jù) Dukes分期： A + B 期33例，C + D 期 27 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例。以同期結(jié)直腸腺瘤手術(shù)存檔的蠟塊以及癌旁超過5 cm的正常結(jié)直腸組織病理蠟塊各40例為對照組。

1.2 方法

標本固定利用10%中性福爾馬林，經(jīng)石蠟包埋，并予以連續(xù)切片處理，厚度為4μm，然后再予以HE和免疫組化染色處理。本研究所用的試劑主要有：兔抗人 Survivin多克隆抗體（由“福州邁新公司”提供），β-catenin多克隆抗體（由“Abcam公司”提供），SP試劑盒、PBS緩沖液以及枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液及SP試劑盒都由“福州邁新公司”提供。染色時，嚴格按照相關(guān)說明書中的內(nèi)容進行，并在實驗過程中設(shè)置陰性和陽性對照。

1.3 結(jié)果評價

在機體的細胞膜、細胞核與細胞質(zhì)中，β-catenin均可定位，陽性細胞為淡黃-棕黃色的顆粒，若細胞提示陽性，即可判斷為異常表達。若β-catenin≤50%細胞核陽性，提示低表達；若β-catenin＞50%細胞核陽性，提示高表達。

由兩名高資歷且臨床經(jīng)驗豐富的醫(yī)師進行閱片，于光鏡下對陽性細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)細胞為棕褐色細顆粒狀。在細胞核亦或者是細胞質(zhì)中，Survivin 都能定位和表達。按照相關(guān)標準，也就是從腫瘤細胞陽性數(shù)和染色反應(yīng)強度這兩方面上進行判斷。其中，染色強度的判斷標準為：無陽性著色-0分，淡黃色-1分，棕黃色-2分，棕褐色-3分。采取隨機法并利用高倍視野計數(shù)100個腫瘤細胞所占的比例，將之分為5級，詳細如下：（1）0分：無陽性表達（或者陽性細胞數(shù)低于 5% ）。（2）1分：5 ～ 25 %。（3）2分：26 ～ 50 %。（4）3 分：51 ～ 75 % 。（5）4 分：＞ 75 %。計算兩項評分之和，4分提示陽性，0分提示陰性。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

β-catenin能夠在細胞膜、細胞核和細胞質(zhì)中進行定位，陽性細胞為淡黃-棕黃色的顆粒，見表1。細胞核陽在結(jié)直腸癌中的異常表達。β-catenin 在結(jié)直腸癌中的陽性率比結(jié)直腸腺瘤以及癌旁正常結(jié)直腸組織高，P=0。Survivin 蛋白在細胞質(zhì)已著手細胞核定位。結(jié)直腸癌的Survivin陽性率比結(jié)直腸腺瘤與癌旁正常結(jié)直腸組織高，P=0 。

表1 β-catenin和Survivin在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤和癌旁正常組織中的陽性表達率[例（%）]

結(jié)直腸癌中β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達的相關(guān)性。結(jié)直腸癌中β-catenin和Survivin 蛋白的表達呈正相關(guān)（ r= 0. 173，P= 0. 027），見表 2 。

表2 結(jié)直腸癌中β-catenin和Survivin表達的相關(guān)性

β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系。β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達與結(jié)直腸癌患者性別、年齡和腫瘤大小比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 3 。

3 討論與結(jié)論

大量研究[4-6]表明，在消化道惡性腫瘤類疾病中，結(jié)直腸癌具有比較高的發(fā)病率，且可致人死亡，近幾年來，該病的發(fā)病率顯著升高，已經(jīng)對人類的生命健康造成了較大的威脅。 而凋亡抑制基因表達于直腸細胞中亦或者是抑癌基因突變則是引發(fā)直腸癌的重要原因[7]。

Wnt信號通路能夠?qū)毎纳L、分化以及運動進行調(diào)控，且其也參加了胚胎到成體的胚胎早期的發(fā)育過程，能夠?qū)毎姆只⒃鲋?、凋亡與生長進行調(diào)控。作為生物進化期間比較保守的一條通路，在正常且成熟的細胞當中，Wnt信號通路處于關(guān)閉狀態(tài)。其在胚胎細胞黏附、細胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用[8]。Wnt包含有多條信號通路，其中比較常見的有經(jīng)典Wnt信號通路，也就是Wnt/β-catenin信號通路。其中，β-catenin 是通路中比較重要的一個信號傳遞子，同時也是一個樞紐因子。而β-catenin 蛋白則能起到抑制癌細胞侵襲以及激活通路的作用。在正常細胞當中，β- catenin 蛋白以及細胞膜上的軸蛋白和鈣黏蛋白會相互結(jié)合，并形成一種降解復(fù)合物，使得細胞質(zhì)中的β- catenin 蛋白較低[9]。Wnt異常激活后，會對β-catenin 蛋白的降解進行抑制，使得β-catenin 蛋白大量進入細胞質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)位入細胞核中，與TCF/LEF相結(jié)合并形成復(fù)合體，同時對通路下游的靶基因進行激活，使得細胞發(fā)生了異常增殖的情況，進而加快了腫瘤形成的速度[10]。相關(guān)資料中提及，Wnt/β-catenin信號通路的異常和多種腫瘤疾病密切相關(guān)，如胃癌、肝癌等[11-12]。此外，也有報道稱[13-17]，在胰腺癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌以及卵巢癌等惡性腫瘤當中，Survivin 都呈現(xiàn)出了高表達的情況。

表3 β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系

近幾年來，人們通過研究發(fā)現(xiàn)了另一個凋亡抑制蛋白家族成員，也就是Survivin，為凋亡抑制劑，能夠起到促細胞增殖以及抑制細胞凋亡的作用，通過對該基因進行有效地抑制，能夠加快腫瘤細胞凋亡的速度。本研究顯示，在結(jié)直腸癌中β-catenin與Survivin的表達比結(jié)直腸腺瘤以及癌旁正常組織高（P＜0.05）。β-Catenin、Survivin 表達與腫瘤大小、性別以及年齡無任何相關(guān)性（P＞0.05），但與結(jié)直腸癌的 Dukes分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。本實驗中，β-catenin細胞核高表達與多種因素密切相關(guān)，包括結(jié)直腸癌組織的Dukes分期、分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。表明 β-catenin細胞核的表達量是診斷結(jié)直腸癌和判斷患者預(yù)后的一種重要指標[18]，主要可能為，β-catenin細胞核的表達和細胞增殖、襲轉(zhuǎn)移與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄和表達密切相關(guān)。另外，本組實驗中，Survivin 在結(jié)直腸癌、腺瘤及正常組織中的表達是逐漸降低的，本研究結(jié)果與 Adamkov等[19]的研究一致。對于結(jié)直腸癌患者來說，腫瘤惡性程度的加重以及病情的進展，能夠增加Survivin 的表達，提示 Survivin 的表達能夠反映出結(jié)直腸癌的發(fā)生與進展，因此，Survivin具有非常高的應(yīng)用價值，有助于臨床醫(yī)師診斷結(jié)直腸癌。

在結(jié)直腸癌的發(fā)病和進展中，β-catenin蛋白和Survivin蛋白高表達起著至關(guān)重要的作用。部分結(jié)直腸癌是從腺瘤發(fā)展而來的，聯(lián)合檢測β-catenin蛋白和Survivin蛋白有助于了解結(jié)直腸腫瘤的生物學行為并對患者的早期診斷、判斷預(yù)后提供分子生物學的支持，有望成為結(jié)直腸癌的基因分型及基因治療的新靶點。