分子育種技術在肉牛育種中的應用研究進展

丁麗艷 殷元虎 韓永勝 宋斌 丁得利 李同豹 孫芳

摘要：隨著分子遺傳學和現代生物技術的快速發展，分子數量遺傳學也得到了相應發展，這為分子育種技術的發展和進一步應用提供了基礎與保障。與傳統的育種方法相比，動物分子育種是直接在分子水平上對性狀的基因進行選擇，因此選種和育種的準確性都非常更高。現綜述分子育種技術在肉牛育種中應用進展，為肉牛分子育種技術的應用提供參考。

關鍵詞：肉牛;分子育種;墓因診斷;應用

中圖分類號：S823.5 文獻標識碼：B 文章編號：2095-9737（2018）10-0021 -2

自20世紀80年代以來，隨著信息技術和分子生物技術的迅猛發展，動物分子育種技術的研究取得了一系列突破性的進展，動物的育種技術已逐漸從宏觀的群體水平進入微觀的分子水平，隨著動物分子育種理論基礎不斷完善，應用技術不斷成熟，各種現代生物技術的綜合應用，肉牛分子育種工作取得了突飛猛進的發展。

1 分子育種技術在肉牛品種間親緣關系的診斷

應用分子診斷技術能夠檢測各品種牛間的親緣關系的遠近。Mannen et al應用線粒體分析亞洲各國牛mtDNA控制區的序列變異頻率以了解牛的起源，結果發現1/5蒙古牛攜帶瘤牛單倍體，而日本牛和韓國牛攜帶普通牛的單倍體。Kierstein et al應用線粒體分析不同來源水牛品種mtDNA D-loop序列，發現128個多態位點和36個mtDNA單倍體，分析表明沼澤型水牛和河流型水牛訓化地點都可能是亞洲次大陸。Tu et al用分子診斷技術分析了牦牛mtD-NA多態性，發現牦牛與普通牛多態性區別明顯，依此估測到牦牛和普通牛祖先分化時間大約相差十萬年。

Amano et al用分子診斷技術分析了沼澤水牛與湖泊水牛及水牛與家牛之間的遺傳關系，發現不同生存環境下的水牛遺傳關系較近，而水牛與家牛之間的親緣關系較遠。孟彥采用SSCP方法對11個中國地方黃牛個體線粒體DNAD-loop序列和12S rRNA基因的多態性研究，結果表明日本黑牛、安格斯牛和海福特牛親緣關系較近，而西門塔爾牛、蒙古牛、延邊牛親緣關系較近。

2 分子育種技術在肉牛生長發育相關性狀基因中的分子診斷

肉牛的生長發育候選基因的研究涉及肉牛的體重、體高、體長、十字部高、腰角寬和日增重等，主要包含ACAN、POUIF1、LPL、GH、IGF、DGAT2等基因。

ACAN是核心蛋白聚糖的一種，是牛矮小癥狀的主要候選基因。Cavanagh et al發現攜帶ACAN基因的牛在生長過程中表現侏儒癥。POUIF1基因在牛胚胎分化和生長發育過程中具有重要的作用，通過促進GH、PRL和TSHβ及自身基因的轉錄，來實現對牛生長發育等性狀的調控，促進相關基因細胞系的生長和發育。劉波等通過試驗發現POUIF1-E6H基因座與秦川牛的體重、體尺等生長性狀之間存在相關性，胸圍、十字部高指標相比，AB和BB基因型個體顯著高于AA型個體，且相關基因與育肥性狀關系較大。LPL是一種脂肪分解酶，在脂蛋白中的載脂蛋白C2的輔助和催化下，LPL在脂類代謝和運輸中發揮著重要作用。邱國宇利用秦川牛和南陽牛為研究對象，研究LPL基因多態性與牛生長發育性狀的關系，結果表明秦川牛雜合子（AB）型基因，在體重、體高、十字部高、體斜長、胸圍和尻長指標上顯著高于純合子（AA和BB），而南陽牛雜合子（AB）個體在初生重指標上顯著高于純合子（AA、BB）個體。

GH是由腦垂體前葉細胞分泌的一種單一肽鏈的生長激素，它能調節牛的所有組織和細胞的生理功能，控制著牛的生長激素分泌水平和生長發育。Sneyers研究發現在7月齡和13月齡比利時牛自花公牛群體中，基因型AA個體體重高于AB型，且GH的多態性與肉牛的瘦肉率也有一定的相關性。高雪等對GH基因研究表明GH-P3即第5外顯子2141bp處和3'的GH-P4位點顯著影響牛的體重、體高、體斜長、胸圍和肉用指數。IGF是一種生長激素依賴性多肽，它可以促進蛋白同化和有絲分裂作用，調節細胞增生及分化IGF有IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種類型。IGF-Ⅱ調節胚胎時期的發育，IGF-Ⅰ則調節出生后的個體生長和發育。DGAT2是合成甘油三酸脂過程中的關鍵酶，在脂肪代謝、脂類在組織中的沉積、腸道脂肪的吸收中發揮重要作用。張爭鋒等研究南陽牛DGAT2基因第6內含子多態性與體重、體尺性狀的關系，結果表明2歲體重、6月齡體高、6月齡到2歲的胸圍和體斜長相比，AA基因型南陽牛個體顯著地高于雜合基因型AB。

3 分子育種技術在肉牛桐體和肉質相關性狀基因中的分子診斷

隨著生活水平的提高，人們對肉質的要求越來越高，因此對肉質性狀基因的研究成為肉牛育種工作中的一個重點。主要衡量指標有胭體重、大理石花紋等級、眼肌面積、背膘厚度、瘦肉率、嫩度、肌肉pH值、肌肉剪切力等，主要相關基因

MSTN基因突變可使牛出現雙肌性狀，在同一飼養條件下，雙肌牛產肉性能是普通牛的1.3倍，且骨骼較細，肌肉發達、瘦肉率高、肉質細嫩。McPherron et al在對比利時藍白花雙肌牛研究中發現，MSTN基因的11個核苷酸缺失導使MSTN基因所翻譯出的蛋白質改變，失去了抑制肌肉生長的功能，表現出肌肉增大現象。而鈣激活蛋白酶（cal-pains）是痕橡基的蛋白酶，主要位于肌纖維附近和肌質網膜上，在動物屠宰后的肉成熟過程中起著著色的作用，同工酶μ-calpaind能夠分解肌肉細胞中的蛋白質，從而起到嫩化肌肉的作用。FABPS即脂肪酸結合蛋白，在脂肪酸生成過程中參與細胞內脂肪酸的運輸，加強脂肪酸的轉運擴散，參與細胞內脂肪酸的攝取，促進細胞膜吸附脂肪酸，調整細胞內脂肪酸的濃度。

MyoD1基因參與動物體多種分化細胞轉化為肌細胞的生產過程，是骨骼生長和再生過程的一個轉化因子，影響著肌肉組織結構的表達。黃萌等以秦川牛、魯西牛和西門塔爾牛為研究對象，利用PCR-RFLP法分析MyoD1基因多態性與相應牛個體的胭體性狀關聯性，結果表明MyoD1基因C1867T位點對肉牛的背膘厚、大腿肉厚度的影響差異極顯著。PRKAG3是蛋白激酶（AMPK）的r3亞基構成的三聚體，具有肌肉特異表達的特性，通過對七個品種牛的PRK-AG3基因多態性研究發現第4內含子存在兩處突變，且不同基因型對應的嫩度性狀差異顯著，同時也影響牛肉的pH值和色澤。

4 分子育種技術在肉牛繁殖相關性狀基因中的分子診斷

繁殖性狀是牛育種中一個重要的性狀，繁殖性能的高低直接影響養殖業的經濟效益。繁殖性狀涉及牛的雙胎性能，一般自然狀態下，牛為單胎動物，雙胎率只有0.15%左右。牛的繁殖性狀候選基因主要包括FSHR、LH、GDF9、RXRG、GnRH等。

FSHR為促卵泡素受體基因，是G蛋白耦合受體。雷雪芹等以秦川牛單、雙胎母牛為對象研究FSHR基因的多態性，結果雙胎母牛的雙胎牛和單胎牛之間FSHR基因的第10個外顯子的突變率差異顯著。魏伍川等也研究表明FSHR基因與牛的繁殖性狀存在連鎖相關。LH是促黃體素基因，與促卵泡素FSH協同促進卵泡生長成熟，參與內膜細胞合成雌激素，誘發動物排卵，促進黃體生成，LH由α和β兩個亞基因構成。劉繼豐等發現LHβ不同基因型西門塔爾牛和夏洛牛的凍精畸形率和射精量顯著不同，這表明LHR基因是影響精液品質的一個主效基因。GDF9即生長分化因子9基因，是卵母細胞分泌的生長因子，調節卵巢卵泡的生長和分化，對動物繁殖起著重要作用。張路培等E227以魯西黃牛為研究對象，發現在GDF9的3' UTR缺失突變，且雙胎牛的B等位基因頻率顯著高于單胎牛。RXRG即視黃酸X受體γ基基因，參與上皮細胞生長、細胞分化、胎兒發育等作用。RXRG基因定位于牛的3號染色體上，在肌肉中完全表達。黃萌等研究發現不同基因型魯西單、雙胎牛RXRG基因位于3' UTR多態位點差異極顯著，這表明RXRG基因與魯西牛雙胎性狀具有密切相關性。GnRH即促性腺激素釋放激素，與特異性受體（GnRHR）結合后，通過調節LH和FSH的水平來刺激性激素的產生、卵泡和精子的發育，從而調控卵巢和攀丸的功能，因此在繁殖中起到重要作用，外源

5 分子育種技術在肉牛毛色性狀相關基因中的分子診斷

牛的毛色是品種的重要特征，可以根據毛色來判斷個體的純系程度，且毛色與牛乳、肉的生產性能也有一定的關系。牛的皮膚和毛的色素是由“黑色素”物質構成的，黑色素的合成是調控系統作用的結果。目前與黑色素細胞發育相關的基因主要包括MC1R、Agouti等基因。

MCIR是黑素皮質素受體1基因，是調節真黑色素形成的關鍵受體。MCIR有α-MSH和ACTH兩種配體，α-MSH能夠促進黑色素細胞進行有絲分裂，促進黑素源的形成，通過黑素體的擴散，使動物皮膚變黑。α-MSH與ACTH結合，可引起cAMP水平的提高，激發酷氨酸酶的增加，從而導致真黑素的形成。Maudet et al對不同毛色的4個品種牛進行了基因分析，結果發現MCIR基因呈多態性，并測出四個基因型，ED、E+、E1、e。Shinji等用分子診斷技術分析了日本黑牛、褐色牛和朝鮮牛的MCIR基因型的頻率，結果發現褐色牛遠小于朝鮮牛的e基因型頻率，但兩種牛的毛色卻很相似，推斷牛的毛色還由其他基因決定。進一步研究表明Agouti基因的表達與否會引起偽黑素的產生和真黑素的轉換表達Agouti對牛的脂肪組織具有調控作用。Michael應用分子診斷技術對8個品種牛中提取的毛Agouti的mRNA，發現有3種mRNA有5'端的非翻譯區發現突變。

6 分子育種技術在肉牛抗病性相關基因中的診斷

在牛育種中，抗病性基因的診斷也是育種的重點，牛的抗病性相關基因主要是MHC-DRB基因，它是牛主要組織相容性復合物（MHC）基因家族中的Ⅱ類基因，是主要的功能基因，經研究MHC-DRB基因編碼的MHC抗原與免疫應答和牛的抗病有著密切的關系。王興平等利用PCR-RFLP技術在魯西牛、秦川牛、晉南牛和南陽牛群體中發現DRB3.2基因第2外顯子的第154位C突變為A。包鵬甲等采用分子診斷技術對三個品種的牦牛個體的BoLA-DRB3基因進行分析，結果三個品種的個體間DRB3基因具有高度多態性，這表明BOLA-DRB3多態性在牦牛抗病育種方面具有獨特作用。

7 結語

雖然分子育種技術在牛的品種間親緣關系的診斷，生長發育、月同體和肉質、繁殖、毛色及抗病性狀相關基因的診斷方面取得了一定的進展，但是分子育種技術的研究還不夠完善，許多功能基因的研究只限于局部的某一片段，還缺少該功能基因的全部基因序列的研究，且不能作為獨立的育種技術進行應用。但是隨著分子生物技術的不斷提高，研究的不斷深入，分子育種技術基礎將會越來越完善，應用條件將日臻成熟，分子育種技術會在肉牛育種中廣泛應用，在育種中發揮重要作用。