蜂膠中總黃酮的提取與紫外可見分光光度計的測定

梁鳳珍

摘 要：蜂膠是蜜蜂從植物的樹芽、樹皮等部位采集的樹脂，再混以蜜蜂舌腺、蠟腺等腺體的分泌物，經蜜蜂加工轉化而成的一種膠狀物質。蜂膠中含有大量的黃酮類化合物。黃酮類化合物有很好的藥用價值，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、消炎鎮痛、防腐保鮮等多種功效，能增加機體免疫力，促進組織再生，已越來越廣泛地應用于醫藥、食品、化妝品等領域。近年來已有很多學者研究了從蜂膠中提取黃酮類化合物的工藝方法，提出了很多新型的、較優的提取工藝方法;并研究了很多黃酮類化合物的測定方法。本文采用最常用最簡單的分析方法-紫外可見分光光度法，在相關文獻的基礎上對蜂膠中總黃酮的提取與測定進行研究，研究了提取條件（提取方式、提取時間，提取劑濃度）對蜂膠中總黃酮的提取率的影響;研究了參比溶液的選擇以及顯色劑的選用、酸度、顯色時間對測定結果的影響。通過紫外分光光度法，對蜂膠中的總黃酮進行測定，建立的線性回歸方程線性良好，R2=0.9999;線性范圍寬，0～20μg/mL;回收率102.4%;檢出限0.162μg/mL。實驗結果表明，紫外可見分光光度法簡單可行，準確度高，相對標準偏差小，檢出限低，是測定蜂膠提取物中總黃酮含量的一種經濟有效的方法。

關鍵詞：蜂膠;總黃酮;提取;測定;紫外可見分光光度

1 實驗部分

1.1 實驗原理

蜂膠中主要含有黃酮類和黃酮醇化合物，利用3、5位有羥基的黃酮與Al+可生成螯合物，顯黃色，在最大吸收峰波長415nm左右處測定其吸光度。在415nm左右范圍內，其吸光度與黃酮類化合物的含量成正比。以蘆丁為對照品，建立標準曲線，定量測試黃酮類化合物的含量。

1.2 實驗儀器和實驗試劑

1.2.1 實驗儀器

UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司;AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2.2 實驗試劑的配制

①0.1mol/L AlCl3：稱取1.21g AlCl3·6H2O于小燒杯中加水溶解，轉移到50mL容量瓶中，加水到刻度，搖勻;

②200μg/mL蘆丁儲備液：準確稱取0.0100g蘆丁與小燒杯中加無水乙醇溶解，轉移到50mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻;

③95%乙醇：量取95mL無水乙醇至250mL燒杯中，加5mL水，混勻。

1.3 實驗操作步驟

1.3.1 樣品處理

去掉蜂膠膠囊外層的膠囊皮，準確稱取膠囊里層的粉末，置于小燒杯中，加95%乙醇30mL，用玻璃棒在室溫下不斷攪拌5min，轉移至100mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。過濾，棄去開始濾液，去中間濾液若干毫升待測。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密吸取蘆丁儲備液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL分別置于10mL容量瓶中，加無水乙醇至總體積為4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，搖勻。靜置30min。以40%乙醇溶液為參比，在350nm～500nm進行掃描，在最大吸收峰波長處，測定其吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程。

1.3.3 樣品空白的制備

精確吸取1.00mL樣品溶液置于10mL容量瓶中，加無水乙醇至總體積為4mL，加水至刻度，搖勻。

1.3.4 樣品測定

精確吸取1.00mL樣品溶液置于10mL容量瓶中，加無水乙醇至總體積為4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，搖勻。靜置30min。以樣品空白為參比，在與標準曲線相同的測試波長處，測定其樣品的吸光度。通過標準曲線回歸計算其樣品中總黃酮的濃度，從而計算樣品中總黃酮含量。

1.4 計算樣品中總黃酮的含量

X=C*10/1*100/m*/1000，式中：X：樣品中總黃酮的含量，單位mg/g;C：由標準曲線回歸方程，計算得到的樣品中總黃酮的濃度，單位μg/mL;m：樣品的質量，單位g。

2 結果與討論

2.1 蜂膠中黃酮類化合物的提取

2.1.1 提取方式

準確稱取三份樣品，用95%乙醇提取劑分別用普通65℃水浴回流30min、超聲波65℃水浴回流30min、室溫下攪拌5min三種提取方式提取。實驗結果如表3-1。從表中實驗結果可以看出，不同的提取方式對提取樣品中黃酮類化合物的含量幾乎沒有影響。

2.1.2 提取時間

準確稱取三份樣品，用95%乙醇提取劑，用超聲波在65℃水浴下分別回流10min、30min、60min。實驗結果如表3-2。從表中實驗結果可以看出，提取時間對提取樣品中黃酮類化合物的含量幾乎沒有影響。

2.1.3 乙醇提取劑的濃度

準確稱取五份樣品，分別用60%、70%、80%、95%、無水乙醇提取劑，在室溫下攪拌5min提取。實驗結果如表3-3。在實驗過程中，加入不同濃度的乙醇提取劑后，發現用60%、70%乙醇的樣品溶解程度很差，在溶液上層有很多懸浮物，且溶液呈灰色;而用80%、95%、無水乙醇提取劑的樣品溶解程度很好，在溶液上層沒有懸浮物，溶液呈黃色。從表中實驗結果可以看出，用60%、70%乙醇提取樣品中總黃酮的含量很低，而用95%乙醇提取樣品中總黃酮的含量效果較好。根據本實驗研究，根據本實驗原料的特點，選用最簡便、最省時、提取效果較優的方法，即用95%乙醇作提取劑，在室溫下用玻璃棒攪拌5min來提取蜂膠樣品中的總黃酮。

2.2 顯色劑的選擇

選用不同的顯色劑體系，溶液的pH值也不同，使得溶液的最大吸收峰波長不同，測得的溶液吸光度也不同，如表3-4。表中畫“-”格表示樣品溶液在400～650nm吸收峰型不明顯，沒有測其吸光度和溶液pH值，而顯色劑為亞硝酸鈉+硝酸鋁+氫氧化鈉時，蘆丁溶液的吸光度很小，可能是大部分黃酮類化合物不顯色所致。有時候蘆丁溶液在400～650nm處波長掃描，最大吸收峰峰型也不明顯，可能是黃酮分子在堿性條件下，與Al3+ 形成的紅色絡合物性質不穩定，隨著時間的推移會很快褪色，影響測定結果;且蜂膠中黃酮在亞硝酸鈉+硝酸鋁+氫氧化鈉顯色體系下，只有少數的黃烷醇類或具有糖結構的黃酮可以在這個顯色體系下顯紅色，而部分多羥基黃酮在這個顯色體系下不能顯色、顯黃色或者微弱的紅色，很多不是黃酮類的物質在這體系下也會顯色，使得測得的總黃酮的含量偏差很大，所以不選用顯色劑為亞硝酸鈉+硝酸鋁+氫氧化鈉。從表中數據可以看出，蘆丁溶液在pH值大時吸光度大，而樣品溶液在pH值大時吸光度小;顯色劑為硝酸鋁時，蘆丁溶液的最大吸收峰波長和樣品溶液的最大吸收峰波長相差甚遠。選用使得蘆丁溶液的最大吸收峰波長和樣品溶液的最大吸收峰波長相近，且兩者的吸光度較大的顯色劑，所以選用氯化鋁作顯色劑。選用氯化鋁作顯色劑是在酸性條件下測定，避免了Al3+在堿性條件下產生沉淀，影響測定結果。

2.3 參比溶液的選擇

由于對照品蘆丁比較純凈，無干擾，且顯色劑又為無色，所以選用溶劑做參比，即用40%乙醇做參比。當然用試劑參比也是可以的，用40%乙醇作參比時，試劑空白也幾乎沒有吸收，所以用試劑空白作參比影響也不大。由于樣品比較復雜，且含有有色離子，如果使用溶劑參比，會有干擾，使吸收曲線峰型不明顯，所以選用樣品參比。

2.4 標準曲線繪制及其線性范圍

精密吸取蘆丁儲備液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL分別置于10mL容量瓶中，加無水乙醇至總體積為4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，搖勻。靜置30min。以40%乙醇溶液為參比，在350nm～500nm進行波長掃描，測得其最大吸收峰波長為413nm，在最大吸收峰波長處，測定其吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線線性回歸方程，如表3-5。

得到標準曲線線性回歸方程為y=0.0268x-0.001，相關系數為0.9999，線性范圍為0～20μg/mL。表明本方法在該濃度范圍內有良好的線性關系。

2.5 加標回收率

為了驗證實驗所測得結果的準確性，做加標回收率實驗來說明。吸取樣品溶液0.50mL于6個10mL容量瓶中，分別加入蘆丁儲備液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL，加入無水乙醇至總體積為4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，搖勻。靜置30min。以樣品空白為參比，在與標準曲線相同的測試波長處，測定其樣品的吸光度。實驗結果如表3-6。

2.6 檢出限

檢出限指的是可檢出樣品中某元素的最小量。因此檢出限是衡量一個方法好壞的重要技術指標之一。

本次實驗的檢出限由下式求得：DL=3×SD/K

其中SD為標準偏差，即連續10次測量試劑空白溶液（即標準曲線的繪制中加0.00mL蘆丁的溶液）的吸光度的標準偏差;K為標準曲線的斜率。實驗結果如表3-7、表3-8。

3 結論

本文用95%乙醇作為浸取劑，對蜂膠中黃酮類化合物進行提取是可行的，提取率也是比較高的，儀器簡單，操作簡便，省時。通過紫外分光光度法，對蜂膠中的總黃酮進行測定，建立的線性回歸方程線性良好，R2=0.9999;線性范圍寬，0～20μg/mL;加標回收率102.4%;檢出限0.162μg/mL。實驗結果表明，紫外可見分光光度法簡單可行，準確度高，相對標準偏差小，檢出限低，是測定蜂膠提取物中總黃酮含量的一種經濟有效的方法。

參考文獻：

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