濁點(diǎn)萃取法提取穿心蓮內(nèi)酯的工藝研究

周敏　鄒毅　廖禹東

摘 要：目的：濁點(diǎn)萃取法在提取穿心蓮內(nèi)酯的工藝及影響因素，分析其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。方法：濁點(diǎn)萃取法提取穿心蓮內(nèi)酯，并測(cè)定其含量，再對(duì)比分析其影響萃取率的主要因素。結(jié)果：明確了濁點(diǎn)萃取技術(shù)應(yīng)用中表面活性劑的選擇，Genapol X-080濃度、鹽濃度、平衡溫度及平衡時(shí)間等都是影響萃取率的主要因素。結(jié)論：濁點(diǎn)萃取是最新出現(xiàn)的一種“液-液萃取技術(shù)”，與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比更具實(shí)效性。

關(guān)鍵詞：穿心蓮內(nèi)酯;濁點(diǎn)萃取;工藝;高效液相色譜

穿心蓮全草均藥，具有清熱解毒、消炎、消腫、止痛等功效，其穿心蓮內(nèi)脂對(duì)類(lèi)激素和類(lèi)蛋白轉(zhuǎn)換酶具有良好的抑制性，極有可能成為高效抗艾滋病的天然藥物。尤其是魚(yú)腥草中藥制劑被國(guó)家禁止使用的情況下，穿心蓮類(lèi)制劑市場(chǎng)大大拓寬，需求極為旺盛，對(duì)穿心蓮提取工藝提出了更高的要求。

1 濁點(diǎn)萃取法

1 1 儀器與試藥

gilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)）;AS5150A超聲儀;色譜柱（日本島津）;電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）;HH-1型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)）;KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有效公司）;穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品及脫水穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)西格瑪公司）。試劑均為分析純。穿心蓮藥材購(gòu)于樟樹(shù)藥材市場(chǎng)，由我校舒德明教授鑒定為穿心蓮。

1.2 濁點(diǎn)萃取

穿心蓮粉碎后經(jīng)250篩備用。取穿心蓮粉0.2g，置于25mL的離心管中，并加入20mL 0.15g/mL的Genapol X-080水溶液，經(jīng)超聲提取30min，以3500r/min離心10min，取溶液上部清液，加入適量的NaCl溶液，放置于60℃恒溫水浴30min直至溶液顯著分層，再次以3500r/min離心10min，去除下層水相，在上層黏稠活性劑中加入2mL甲醇稀釋?zhuān)⒁?.45濾膜過(guò)濾，獲得檢測(cè)液相。

1.3 對(duì)照混合溶液制備

取穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯各2mg，分別置于10mL的容量瓶中，并加入適量的甲醇溶液稀釋至同一刻度，搖勻后放置4℃冷藏環(huán)境中。

1.4 色譜條件

采用250×4.6mm、5 的安捷倫C18色譜柱，以甲醇-水作為流動(dòng)相，比例為54：46;色譜柱溫度為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為232;流動(dòng)相流速為1mL/min。

1.5 結(jié)果與討論

1.5.1 表面活性劑的選擇

在濁點(diǎn)萃取技術(shù)應(yīng)用中，常用的表面活性劑為T(mén)rition X-114 PONPE-7.5等，但由于這類(lèi)表面活性劑中均含有苯環(huán)，存在紫外檢測(cè)吸收的問(wèn)題。選用Genapol X-080能夠有效避免該問(wèn)題。同時(shí)，該表面活性劑可在42℃時(shí)出現(xiàn)濁點(diǎn)，能有效降低分層條件。

1.5.2 影響萃取率的因素

1.5.2.1 Genapol X-080濃度

加入20mLGenapol X-080作為萃取劑，將其置于60℃恒溫水浴鍋30min時(shí)，Genapol X-080濃度對(duì)萃取穿心蓮的影響，如下表所示。

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)Genapol X-080濃度為0.15g/mL，萃取的穿心蓮內(nèi)酯含量達(dá)到最高，隨著Genapol X-080濃度的升高，萃取的穿心蓮內(nèi)酯含量基本持平。當(dāng)Genapol X-080濃度較高時(shí)分層后的表面活性劑相過(guò)于黏稠，嚴(yán)重影響操作。因此，Genapol X-080以0.15g/mL為宜。

1.5.2.2 鹽濃度

在使用濁點(diǎn)萃取法提取穿心蓮內(nèi)酯時(shí)，惰性鹽在其中起到了縮短萃取時(shí)間，降低萃取物在水中溶解度的作用。因此，在進(jìn)行影響萃取率的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，除了要考慮Genapol X-080濃度，還應(yīng)考慮鹽濃度對(duì)萃取率的影響，實(shí)驗(yàn)考察了20 mL0.15 g/mL的Genapol X -080水溶液，置60℃恒溫水浴中30min時(shí)，不同NaCl濃度對(duì)萃取率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)NaCI濃度達(dá)到1.2 mol/L時(shí)，萃取率最高。

1.5.2.3 平衡溫度

在濁點(diǎn)萃取實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)平衡溫度高于表面活性劑的濁點(diǎn)溫度15℃～20℃，溶液才會(huì)分為兩相。GenapolX-080的濁點(diǎn)溫度為42度，加入20mL 0.15 g/mL的Cenapol X -080水溶液，置恒溫水浴中30min，NaCl濃度達(dá)到1.2 mol/L時(shí)，平衡溫度在55℃～65℃之間萃取率最高，所以選擇60℃為平衡溫度。

1.5.2.4 平衡時(shí)間

當(dāng)固定平衡溫度為60℃時(shí)，鹽濃度為1.2mol/L，根據(jù)平衡時(shí)間的不同，分別測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯在不同時(shí)間的萃取率，結(jié)果表明，當(dāng)平衡時(shí)間在30～40min時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯萃取率達(dá)到最高，因此，平衡時(shí)間應(yīng)優(yōu)先選擇在30min。

1.5.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

按最優(yōu)條件制備同一批樣品的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣18μL，測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積。計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD （n = 6） 分別為2.09%和2.51%。

1.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取已知含量 （其中穿心蓮內(nèi)酯13.81 mg/g，脫水穿心蓮內(nèi)酯5.33 mg/g） 的穿心蓮粉末4份，每份0.2 g，加入穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，按濁點(diǎn)萃取方法操作，制得4份供試品溶液，每次進(jìn)樣18μL，測(cè)定峰面積，并根據(jù)公式：

計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)下表。

2 乙醇直接提取法

2.1 儀器與試藥

SHB-III型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市豫華儀器有限公司）、LC-2010AHT型高效液相色譜儀（日本島津）、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）。乙醇為工業(yè)級(jí)95%，國(guó)產(chǎn)分析純、色譜純?cè)噭┳鳛樵噭Ｆ溆嗤瑵狳c(diǎn)萃取。

2.2 方法

稱(chēng)取穿心蓮粉末10g，纖維素酶50mg，加入純化水50mL，用破酸調(diào)整至pH4，40℃恒溫浸泡1h，減壓過(guò)濾后取濾渣，加100mL85%乙醇溶波浸泡30min，30℃下F超聲（100W）提取30min，減壓過(guò)濾，濾渣用30mL85%乙醇溶液洗滌3次，洗液并入濾液中，60C減壓濃縮至干，得浸膏。按以上方法進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，得到三批浸膏。

2.3色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（5μm，150mmx46mm）;流動(dòng)相為甲醇：水（52：48）;流速1.0mL/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)225nm;進(jìn)樣量5μL。

2.4穿心蓮內(nèi)酯回收率

計(jì)算方法同1.5.4項(xiàng)。得出三次實(shí)驗(yàn)穿心蓮內(nèi)酯回收率分別為82.5%、86.9%、81.7%，平均值為83.7%。

3 結(jié)果與討論

通過(guò)考察濁點(diǎn)萃取穿心蓮內(nèi)酯法與醇提法，得出濁點(diǎn)萃取技術(shù)較傳統(tǒng)萃取技術(shù)更具實(shí)效性、安全性，回收率更高，極大的縮短了萃取時(shí)間，降低了萃取成本，為藥品生產(chǎn)帶來(lái)極大便利，同時(shí)也降低了人們的用藥負(fù)擔(dān)。

參考文獻(xiàn)：

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