淚腺腫瘤組織中GPX3基因mRNA和蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性

邢其棋 劉冬冬 于丹陽

【摘 要】目的：對GPX3基因mRNA和蛋白在淚腺上皮性腫瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性進(jìn)行分析探討。方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)），對2016年1月～2018年1月間來我院治療的淚腺多形性腺瘤（20例），淚腺腺樣囊性癌（15例）及正常淚腺組織（5例）共40例，對其中的谷胱甘肽過氧化物酶3（GPx3）基因mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果：反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示，GPX3 mRNA在正常淚腺組織表達(dá)量為0.89±0.02，在淚腺多形性腺瘤表達(dá)量為0.52±0.02，在淚腺腺樣囊性癌中的表達(dá)量為0.23±0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，GPX3蛋白在正常淚腺組織中的表達(dá)為1988.00±120.03，在淚腺多形性腺瘤中的表達(dá)為760.01±120.30在淚腺腺樣囊性癌中的表達(dá)為0，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：淚腺腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展過程中可能有GPX3的參與，GPX3可作為一種輔助分子標(biāo)記物用以鑒定淚腺腫瘤的良性及惡性。

【關(guān)鍵詞】淚腺腫瘤；GPX3基因；蛋白質(zhì)印跡法；相關(guān)性

淚腺腫塊在臨床上較為多見，占眼眶腫瘤的13%左右，其中最為常見的為淚腺混合瘤，淚腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)具有復(fù)雜性的過程，它和多種基因功能的改變有密不可分的關(guān)系，它是一個(gè)癌基因的激活和抑癌基因的失活步驟。GPX3是近年來在臨床上發(fā)現(xiàn)的抑制癌細(xì)胞作用的基因之一，是GPXs家族中的成員，在臨床惡性腫瘤的病患中低表達(dá)，但在淚腺腫瘤組織中，對GPX3基因mRNA和蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性的相關(guān)分析研究較少，因此，本研究從mRNA及蛋白水平檢測GPX3基因在120例淚腺多形性腺瘤，淚腺腺樣囊性癌及正常淚腺組織中的表達(dá)進(jìn)行分析研究，并對其表達(dá)和淚腺腫瘤發(fā)生與發(fā)展是否有相關(guān)性進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 基本材料

采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)），2016年1月～2018年1月間來我院治療的40例眼科手術(shù)病患，根據(jù)病患的病理檢查結(jié)果，根據(jù)隨機(jī)分組的原則，分為淚腺多形性腺瘤（良性腫瘤20例），淚腺腺樣囊性癌（惡性腫瘤15例）及正常淚腺組織（開放性眼眶損傷5例）三組共40例，對其中的谷胱甘肽過氧化物酶3（glutathione peroxidase 3，GPx3）基因mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。其中男22例，年齡22～72歲，平均年齡（35+12.2歲）。女18例，年齡28～70歲，平均年齡（40+12.2歲）

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有病患術(shù)前均未接受化學(xué)治療和放射治療（2）病患所取標(biāo)本立刻用液氮凍存，并于零下80℃的條件下進(jìn)行存儲(chǔ)。（3）病患均簽署知情同意書。

排出標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)過化療或放療的病患。

1.2主要試劑

（1）RNA試劑及RT—PCR反應(yīng)試劑.（2）抗GPX3兔抗人單克隆抗體。（3）辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（4）鼠抗人內(nèi)參B—actin一抗

1.3 方法

1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測GPX3的mRNA表達(dá)

取病患50mg組織，應(yīng)用Trizol試劑進(jìn)行組織中RNA的提取，經(jīng)Nano-drop分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的檢測。取2ug總RNA，根據(jù)相關(guān)說明逆轉(zhuǎn)合成cDNA。之后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系為：cDNA l uL，聚合酶式反應(yīng)混合物9.5μL，上下游引物各1μL，雙蒸水補(bǔ)至25μL。GPX3引物序列：上游5-TAGGGAGCCCTCAC CATTGAT-3，下游5-CTGAGTTCACTCCTGGTTCCT-3。β-ac-tin引物序列：上游5-CACGATGGAGGGGCCG-GACTCATC.3，下游5-TAAAGACCTCTATGC-CAGT.3。循環(huán)參數(shù)：94℃/4 min，94℃/l min，55℃/1 min，72℃/1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7min。取PCR產(chǎn)物5μL，20g·L-1。1瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行觀察并拍照。應(yīng)用去離子水進(jìn)行陰性對照。通過Quantity-one軟件，進(jìn)行每個(gè)樣本的GPX3表達(dá)水平的計(jì)算，表達(dá)量相對值=待測基因擴(kuò)增條帶的灰度值/13-actin基因擴(kuò)增條帶的灰度值。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測GPX3的蛋白表達(dá)

取病患30μg組織總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳80V，待蛋白至分離膠后120 V。濕轉(zhuǎn)220 mA，2h后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。首先，取50g·L-1脫脂奶粉進(jìn)行l(wèi)h的封閉后加入l：1000的l×TBS稀釋的一抗GPX3，保持在4℃保存至過夜，進(jìn)行洗膜3次/10min。之后，加入l：3000的l×TBS稀釋的二抗，室溫下靜置1h后洗膜3次/10 min。再次，加入l：1000的l×TBS稀釋的鼠抗人內(nèi)參B-actin一抗，保持4℃儲(chǔ)存至過夜，進(jìn)行洗膜3次/10 min。最后，加入1：3000的l×TBS稀釋的二抗，在室溫下靜置lh后進(jìn)行洗膜3次/10min。最終在暗室狀態(tài)下加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行曝光顯影。應(yīng)用軟件Quantity-one機(jī)型各個(gè)樣本GPX3蛋白表達(dá)水平的計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用FisherS精確檢驗(yàn)法進(jìn)行三組間的比對，其次采用χ2檢驗(yàn)GPX3在不同性別，年齡和腫瘤大小間在淚腺上皮性腫瘤中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。最后使用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS21.0的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和對比分析。

2 結(jié)果

2.1正常淚腺組織與良性淚腺腫瘤及惡性淚腺腫瘤組織中GPX3 mRNA的表達(dá)

正常淚腺組織中GPX3mRNA表達(dá)量顯著高于淚腺多形性腺瘤，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳情見圖一；正常淚腺組織與淚腺腺樣囊性癌GPX3 mRNA的轉(zhuǎn)錄結(jié)果詳情見表一。

2.2 正常淚腺組織與良性淚腺腫瘤和惡性淚腺腫瘤組織中GPX3蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，GPX3蛋白在正常淚腺組織和良，惡性淚腺腫瘤組織中的表達(dá)分別為1988.00±120.03，760.01±120.30，0，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳情見表二。GPX3蛋白表達(dá)量在正常淚腺組織中較淚腺多形性腺瘤高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳情見圖二。

3 討論

腫瘤的發(fā)生至發(fā)展至惡變過程是由于多種因素造成的，它是經(jīng)多個(gè)階段和步驟的基因發(fā)生改變的過程。而眼眶內(nèi)多發(fā)的腫瘤之一就是淚腺上皮性腫瘤，其良性腫瘤的惡變率較高，而惡性腫瘤的死亡率和復(fù)發(fā)率更高。所以，研究淚腺良性腫瘤和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲的生物學(xué)指標(biāo)轉(zhuǎn)移過程，在臨床上具有重要含義。因?yàn)椴』俭w內(nèi)活性氧簇的平衡是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵，而癌細(xì)胞的特點(diǎn)是活性氧的清除能力下降，但是活性氧簇的產(chǎn)量大量增加，而活性氧簇可以起到抑制凋亡的作用，而很多類型的酶例如超氧化物歧化酶，GPX和抗氧化物的過氧化氫酶可以起到中和活性氧簇的酶類作用下降的作用。GPX3基因主要位于在腫瘤中常見的染色體雜合性缺失位點(diǎn)5q23，其主要合成部分是腎臟的近端小管，它是一種典型性的前導(dǎo)序列的胞外酶。它被認(rèn)為具有抑制癌細(xì)胞基因活性的作用。

本研究結(jié)果顯示，正常淚腺組織中GPX3mRNA表達(dá)量顯著高于淚腺多形性腺瘤，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明淚腺腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展過程中可能有GPX3的參與。

綜上所述，GPX3蛋白表達(dá)參與了惡性淚腺組織的發(fā)生和發(fā)展，在臨床中對GPX3蛋白進(jìn)行檢測，有利于進(jìn)行臨床淚腺腫瘤的早期診斷和愈后判斷。

參考文獻(xiàn)：

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