高通量測序技術在腫瘤臨床上的應用

孫吉 張坤馳

摘 要：隨著高通量測序技術的日漸成熟，技術原理和材料工程不斷創新，基礎科研在臨床診療中的應用日趨廣泛，NGS在癌癥基因組學研究領域中的應用越來越廣泛。最近，NGS已被用于臨床腫瘤學以促進癌癥的個體化治療。本文列舉了高通量測序技術在臨床上的腫瘤診斷、治療及預后方面的主要指導作用，并展望了其在腫瘤領域的應用前景。

關鍵詞：高通量測序；腫瘤；診治；預后

1 NGS的簡介

高通量測序技術（Next Generation Sequencing，NGS）是近年來發展成熟的一項前沿技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。[1] NGS是對傳統測序一次革命性的改變，使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，通常包括樣本前處理、測序文庫構建、數據分析解讀等，所以也被稱為深度測序（Deep Sequencing）。[2]

2 NGS的主要平臺

測序技術包括多種方法，基本的原理都是在DNA 進行PCR 擴增時，借助一些化學標志物在堿基插入DNA 鏈時發出的信號來讀取序列信息。大體上它們可被組合為模板制備、測序和成像以及數據分析，可以通過特定方法的獨特組合將不同的平臺區分開，并從每個平臺產生的數據確定其種類。而各平臺有其不同的原理、優點及局限性，如Illumina/Solexa 平臺應用可逆鏈終止物和合成測序法，其價格低廉且通量高數據量大，局限是儀器和用于分析的費用高昂；Life/Solid平臺應用連接測序法，準確度高、成本低，不過讀長短、測序時間長；Roche/454平臺應用焦磷酸測序法，準確度達99%以上，在第二代中具有最高讀長并且比第一代的測序通量大，但無法測量同聚物的長度；Ion Torrent平臺應用半導體技術，直接在化學和數學信息之間建立聯系，具有低成本、快速并準確的優點。[3]

3 NGS在臨床腫瘤診斷、治療及預后方面的應用

3.1 在乳腺癌和卵巢癌方面的應用

NGS用于24個三陰性乳腺癌（TNBC）與14個臨近正常組織獲得的公開可用的小RNA測序數據，重繪不同類型的sncRNAs，發現TNBC中有55個miRNA異常表達，結果多于繼往的研究，為于TNBC的診斷開發了新的工具；有研究將NGS平臺用于臨床難治療的轉移性乳腺癌（mBC），將315個外顯子和28個難治性mBC基因的選擇性內含子測序，使用這種定向的NGS選定分析潛在的可控轉變來描述晚期癌癥患者的突變，該實驗分析為35%的臨床患者提供了幫助；有研究調查了287名連續不相關的意大利婦女受乳腺癌或卵巢癌的影響，利用可靠的拷貝數變異（CNV）預測算法進行NGS輸送，所有樣品用多重擴增子定量（MAQ）分析，而多重連接依賴探針擴增（MLPA）技術作為可能的替代方法，結果表明BRCA1/2基因的重新排列的prevalence是患者中檢測到的所有治病突變的12%，MAQ的結果顯示假陽性結果的2.8%，這種基于NGS的方法完全可以滿足BRCA1/2 LGRs檢測的靈敏性和特異性需求，這種方式是非常易于使用的BRCA1/2篩查方法，并較易在門診檢驗中使用。[4]

3.2 在癌癥免疫治療上的應用

腫瘤基因突變對腫瘤的發生發展起有很大影響。2012發現的T細胞依賴的癌癥進展機制，使得癌癥與免疫治療具備潛在關聯。NGS可以應用于個體化腫瘤臨床治療，可包括個體化的劑量、疫苗開發、基因突變的對癥治療。比如，腫瘤活性淋巴細胞的新抗原和有效遷移的連續識別，促進免疫治療的發展。[5]

近年來，計算機分析能力的開發，NGS數據可有效分析腫瘤-免疫細胞相互作用，如Tlminer方法可以整合免疫原分析，包括：人類白細胞抗原分型、新抗原預測、免疫浸潤特征和腫瘤免疫原性的定量，[6]從小基因集中準確預測個體腫瘤的總突變量（PTML），這種方法已經被應用于指導靶向治療。

4 結論

NGS具有許多優點，檢測速度快、準確率高、成本低 、覆蓋面廣以及產出巨大等特點，[7]能夠在一個單一的測試中以相對低的成本完全測序所有類型的突變（數百到數千個）的所有類型的突變以及與其他測序方式相比的靈敏度、速度。其中對海量的測序數據進行分析，精準鎖定相關突變是NGS的難點，需要進一步的成熟完善。雖然NGS已被用于臨床實踐，NGS可以提供重要的信息來表征癌癥基因組結構的變化，然而，在對疾病全面的認識中，表觀遺傳變異、腫瘤微環境的貢獻和種系遺傳變異也需要列入考慮范圍。

參考文獻：

[1]張文力.高通量測序數據分析現狀與挑戰.集成技術，2012（3）.

[2]白晶.中藥轉錄組學及IncRNA挖掘的應用研究.中國科技信息，2013（21）.

[3]趙躍.下一代半導體測序技術在遺傳性心肌病分子診斷中的應用.遺傳，2015（7）.

[4]Concolino P，Rizza R，Mignone F，et al.A comprehensive BRCA1/2 NGS pipeline for an immediate Copy Number Variation （CNV） detection in breast and ovarian cancer molecular diagnosis[J].Clinica Chimica Acta，2018，480.

[5]Siniard R C，Harada S.Immunogenomics：using genomics to personalize cancer immunotherapy[J].Virchows Archiv，2017，471（2）：1-11.

[6]Tappeiner E，Finotello F，Charoentong P，et al.TIminer：NGS data mining pipeline for cancer immunology and immunotherapy[J].Bioinformatics，2017，33（19）.

[7]周瑩.二代測序技術在臨床醫學上的相關應用.昆明醫科大學學報，2016（3）.