基于顯色反應的神經性毒劑檢測方法研究進展

劉國宏，黃婷婷，于競翔

(陸軍防化學院 化學防護系，北京 102205)

神經性毒劑是毒性最強的化學戰劑，主要包括沙林(GB)、梭曼(GD)、塔崩(GA)、維埃克斯(VX)等。神經性毒劑比糜爛性毒劑、窒息性毒劑和全身中毒劑的毒性大，成為恐怖主義者最常用的化學戰劑[1]。當今社會，化學恐怖從潛在威脅轉向現實威脅的趨勢日益明顯。化學恐怖襲擊危害嚴重，造成的社會和政治影響大，恐怖分子視化學恐怖為“殺手锏”。目前，世界上已發生多起神經性毒劑恐怖事件，例如1995年震驚世界的東京地鐵沙林事件，大量人員受難[2-4]；2017年金正男在吉隆坡機場因中神經性毒劑VX身亡[5]。現場快速檢測有利于神經性毒劑的早期發現和后期處置，因此，發展一種便攜式、可現場檢測神經性毒劑的方法非常必要。

現有的神經性毒劑檢測方法主要有色譜法(氣相色譜[6]、液相色譜[7]、毛細管電泳[8])、波譜法(紅外光譜[9]、拉曼光譜[10-13]、核磁共振法[14]等)、質譜法[15]、催化發光法[16-17]、質量傳感器[18]、離子遷移譜[19]、顯色法[20-22]等。色譜、波譜以及質譜等方法通常在實驗室使用，這些分析方法大多儀器昂貴，需將樣品取至實驗室進行分析，雖檢測結果精確，但費時費力，不易現場檢測；催化發光、質量傳感器、離子遷移譜等方法可用于現場檢測，但存在使用限制，選擇性不高，攜帶不便，使用方式復雜，存在定性不準確或不能定量等問題。顯色法基于顯色反應，反應現象直觀，成本相對低廉，適合現場快速檢測[23]。本文從基于顯色反應的神經性毒劑檢測方法的原理、檢測手段和顯色劑三方面綜述了顯色法在神經性毒劑檢測中的應用現狀，總結了其發展趨勢，提出了顯色法在神經性毒劑檢測中的研究方向。

1 基于顯色反應的神經性毒劑的檢測原理

特異性化學顯色、酶催化反應、納米粒子修飾等均可應用于基于顯色反應的神經性毒劑檢測。在特異性化學顯色中，利用許乃曼反應，神經性毒劑可與過氧化物生成過氧磷酸，過氧磷酸進一步氧化聯苯胺后顯色[24]。在酶催化反應中，乙酰靛酚類化合物可作為膽堿酶是否被抑制的指示劑[25]。Climent課題組則采用巰基和脂肪醇修飾的硅納米粒子對神經性毒劑模擬劑進行顯色檢測[26]。近年來，顯色類試劑或傳感器[27]在神經性毒劑檢測方面受到了關注。上述基于顯色反應的神經性毒劑檢測方法雖然研究內容不同，但其反應原理一致，或基于與磷原子的親核取代，或基于生化反應，主要是利用神經性毒劑對膽堿酯酶的抑制進行顯色檢測。

1.1 基于親核取代的顯色反應檢測原理

1944年，許乃曼在塔崩試劑的偵檢分析時發現，堿性的過氧化氫溶液加入到塔崩溶液中后，能使化學發光試劑發光，也能使鄰甲基苯胺發生顏色變化，該反應被稱為許乃曼反應[28]。1957年，Sass等[29]在此基礎上，對含磷化合物(塔崩、沙林)進行顯色反應研究，探索出許乃曼反應的機理，即：有機磷毒劑與過氧化氫發生親核取代反應，生成過氧磷酸，過氧磷酸氧化聯苯胺類，進而發生顏色改變。

有機磷毒劑與吡啶、苯胺類也能發生親核取代。2011年，西班牙的Royo和Costero等[30]合成了含有N，N-二甲基苯胺供電子基團和偶氮橋連接的吡啶電子受體基團的分子。該分子中的苯胺和吡啶均能與帶有強離去基團的磷酸酯或膦酸酯發生反應。根據生成物顏色的不同可以判斷該磷酸酯是否帶氰基團。2012年，該研究組以合成的2種三芳基甲烷類衍生物作為檢測指示劑，利用三芳基離子上的親核基團，攻擊其磷酸酯或膦酸酯的磷原子中心，使其脫去P-X鍵后脫去磷酸，發生內環化[31]。

同年，廈門大學的研究人員基于羥基與神經性毒劑的親核取代反應[32]，采用羅丹明染料作為指示劑進行顯色研究，該研究采用羅丹明B與5-氨基-1-戊醇發生甲酯氨解生成N-羅丹明B-內酰胺-5-氨基-1-戊醇(dRB-APOH)。內酰胺上的羥基與氟磷酸酯發生親核取代，然后發生環化反應，最終使該合成染料發生熒光性質和顏色上的改變。

在二吡咯(BODIPY)染料上連接羥基合成的化合物，也可用于神經性毒劑檢測。2013年，研究者在BODIPY染料的基礎上合成了用于神經性毒劑檢測的顯色指示劑，利用合成化合物上的羥基與有機磷毒劑發生親核取代反應，生成熒光性質、顏色變化的產物，以達到檢測神經性毒劑的目的[33]。

1.2 基于生化反應的顯色反應檢測原理

神經性毒劑進入人體后作用于神經系統，通過抑制膽堿酯酶活性從而引起乙酰膽堿的蓄積，使膽堿能神經過度興奮，最后導致呼吸、循環系統衰竭死亡[34]。神經性毒劑經酶催化水解后產物或因結構改變致使本身顏色發生變化，或因與加入的其他物質發生反應使顏色間接發生變化，可通過反應前后的顏色變化判斷神經性毒劑是否存在[35]。

除了酶與底物直接反應生色或間接反應生色的方法外，納米材料的應用也提供了一種基于生化反應檢測神經性毒劑的新思路。2005年，以色列研究人員Pavlov等[36]利用抑制劑對乙酰膽堿酯酶(AchE)的作用來刺激金納米粒子的生長，研究了神經性毒劑的顯色檢測方法。2009年，Virel等[37]基于神經性毒劑抑制膽堿酯酶水解乙酰膽堿的原理，研究出一種能控制Ag-Au納米粒子生長的反應體系，以達到檢測神經性毒劑的目的。與Pavlov等的檢測方法不同，該研究組通過Ag-Au納米粒子的生長來判斷神經性毒劑是否存在。硫代膽堿(Tch)在抗壞血酸存在下能控制Ag-Au納米粒子的制備。Virel等建立了一個含有AgNO3、乙酰膽堿酯酶、Au納米粒子(2～3 nm)、L-抗壞血酸和分解底物乙酰膽堿的水溶液體系,在該體系中，乙酰膽堿酯酶水解乙酰硫膽堿生成硫代膽堿，硫代膽堿抑制L-抗壞血酸與Ag+反應生成Ag，導致Ag-Au納米粒子不再繼續生長。而當神經性毒劑抑制了乙酰膽堿酯酶活性，使硫代膽堿不能生成，則L-抗壞血酸與Ag+反應生成Ag，覆蓋Au納米粒子，此時Ag-Au納米粒子繼續生長，溶液產生裸眼可見的顏色變化，據此建立了檢測微量神經性毒劑的方法。

與控制納米粒子的生長不同，2012年我國軍事醫學科學院的研究人員基于神經性毒劑對AchE的抑制作用，在硫辛酸修飾的金納米粒子復合物上建立了神經性毒劑和高毒有機磷農藥顯色的超靈敏檢測方法[38]。該方法中AchE水解ATch生成Tch，誘發硫辛酸修飾的金納米粒子復合物顏色從紅色變為藍色。有機磷農藥作為抑制劑，可以抑制Tch的生成，顏色變化因毒劑不同而不同，如圖1所示。

圖1 硫辛酸修飾的金納米粒子復合物檢測神經性毒劑的機制圖[38]Fig.1 Schematic illustration for the detection of nerve agents based on the aggregation[38]

2 基于顯色反應的神經性毒劑檢測手段

基于顯色法的神經性毒劑檢測方法的研究起步較早，自20世紀神經性毒劑出現開始，其檢測方法不斷發展，可分為裸眼檢測、紫外-可見光檢測、熒光檢測等。

2.1 裸眼檢測

裸眼檢測無需借助任何儀器，肉眼可直接觀察到顯色反應前后顏色的變化，從而判斷有無神經性毒劑存在。El Sayed等[39]合成的顯色探針在氟膦酸二異丙酯(DFP)下有明顯區別于塔崩模擬劑氰基膦酸二乙酯(DCNP)的黃色變化；Gotor等[31]在三芳基甲烷染料的基礎上合成了帶羥基的衍生物，以其為探針與DFP進行親核取代，在水與乙腈混合溶液中檢測DCNP和DFP，前者由無色變為綠色，后者從無色變為紅色；帶有羅丹明染料的指示劑在反應前后的顏色變化很明顯[32]；用BODIPY染料合成相應指示劑后，Climent等[40]觀察到反應前后體系顏色由粉色變為灰黃色。

裸眼檢測可判斷物質的性質并對物質進行初步的半定量，結果直觀，操作簡單。但人眼辨識度低，因此基于人眼觀察的裸眼檢測準確度低，光學儀器的應用則增加了其準確性。

2.2 紫外-可見光檢測

紫外-可見光檢測也是基于顯色反應判斷神經性毒劑是否存在的一種手段，其工作波長在200～800 nm范圍內，用途廣泛。Royo等[30]用紫外-可見光光譜檢測3種不同顏色的反應體系：指示劑、指示劑與氯磷酸二乙酯(DCP)、指示劑與DCNP，3種體系分別呈桔、玫紅、黃色，在紫外-可見光光譜下可明顯看到其吸收帶和波譜的差異，對照體系吸收峰高可獲得相應濃度。Costero等[41]合成的推拉染料指示劑與DCP反應后光譜吸收峰增強，波長藍移。Gotor等[31]用紫外-可見光光譜檢測合成的三芳基甲烷衍生物指示劑，發現指示劑與DCNP和DCP反應后的光譜圖差異大，以此判斷指示劑的檢測性能。

紫外-可見光檢測工作范圍廣泛，是一種常見的顯色法研究手段，也能通過光譜差異辨識物質。

2.3 熒光檢測

化合物的熒光猝滅現象可作為判斷被測物種類的依據，為提高分辨率，可采用熒光光度儀進行檢測。Climent課題組將BODIPY染料用于神經性毒劑的檢測，在熒光光度儀下，其顏色由桔色變為灰綠色，DFP的信號顯著減少，發生了熒光猝滅現象[40]。Barba-Bon等[33]也進行了基于BODIPY染料檢測神經性毒劑的研究，除了觀察到顏色變化，還檢測到熒光波長在反應前后的變化。Wu等[32]在羅丹明染料基礎上合成了一種指示劑，當其與神經性毒劑反應時可以明顯觀察到熒光增強現象。

熒光檢測比裸眼檢測、紫外-可見光檢測更靈敏，人眼無法準確辨別的顏色區別，在熒光檢測下信號差異明顯，更易判斷。

3 用于神經性毒劑顯色檢測的物質

神經性毒劑本身無顏色，反應前后通常不會變色，反應體系中需存在能指示反應前后顏色變化的物質。該物質可直接與神經性毒劑發生反應產生顏色變化，也可與神經性毒劑的反應產物發生反應產生顏色變化。

3.1 聯苯胺類、肟試劑

聯苯胺是在許乃曼反應中發現的顯色劑，過氧磷酸氧化聯苯胺后使聯苯胺發生顏色變化。能與神經性毒劑反應的肟試劑為α-含氧醛肟或酮肟，該試劑可與神經性毒劑發生二級Beckmann反應，生成HCN和相應羧酸，可通過顯色法檢測CN-和羧酸來檢測神經性毒劑[42]。Kumar等[43]使用以吡啶、咪唑和肟等為主要官能團的顯色劑，如苯胺類[24]、米氏酮肟試劑[44]，建立了神經性毒劑的顯色反應檢測方法。

3.2 染 料

染料本身有顏色，能在反應前后發生顏色變化，如三芳基甲烷染料、羅丹明染料、BODPIY染料等。這些染料本身不帶能與神經性毒劑發生親核取代的基團，經人為修飾或合成其衍生物后，可用于神經性毒劑的檢測。2010年，西班牙瓦倫西亞大學研究人員[45]用二芳基甲烷衍生物合成了一系列三芳基甲烷衍生物，然后在乙腈或乙腈-水溶液(3∶1)中反應后進行顯色檢測，原理是基于三芳基甲烷衍生物羥基的磷酸化和去磷酸化，生成碳正離子，結構的改變導致吸收帶發生紅移。同年，該課題組對具有共軛π鍵的推拉式染料檢測神經性毒劑模擬劑的顯色檢測方法進行了研究，這種具有共軛π鍵的推拉式染料結構，能夠在膦酸酯底物存在時發生酰化作用，然后進一步發生分子N-烷基化作用[41]。該法通過特定發色團染料受體與發色團染料結合制作顯色法檢測神經性毒劑的探針分子，神經性毒劑模擬劑能觸發該推拉式染料的環化反應，將二甲胺鹽轉變為季銨鹽。在乙腈或與乙腈-水溶液(3∶1)中反應后該染料的紫外吸收帶發生藍移，基于此可將其用于神經性毒劑的測定。

羅丹明具有內酰胺結構和特殊的光學物理特性，能用于神經性毒劑的檢測。羅丹明在與神經性毒劑反應的過程中能可逆地打開酰胺螺環，變成具有高熒光特性的化合物。我國軍事醫學科學院研究人員合成了能與神經性毒劑反應的羅丹明化合物dRB-APOH，其與神經性毒劑模擬劑發生磷酸化反應后，生成中間產物，再發生環化反應生成內酰胺產物。無熒光特性和無色的合成指示劑與神經性毒劑發生反應后，能生成具有高熒光特性和顏色的物質，從而實現神經性毒劑的測定[32]。

二吡咯(BODIPY)可以吸收可見光范圍的光。2016年，德國、捷克、西班牙的研究人員以BODIPY染料為基礎，合成了能快速檢測塔崩、沙林和梭曼等神經性毒劑的BODIPY改良硅材料[40]。該研究將熒光指示劑BODIPY鍵合到硅介孔微球(SBA)合成混合指示劑，SBA可使該混合指示劑具有更高的反應性和穩定性。該混合指示劑在神經性毒劑作用下從粉色變為灰黃色，并可在數秒內實現對濃度為μg/m3范圍內的神經性毒劑的檢測。Royo團隊研究發現吡啶與神經性毒劑的親核反應可用于檢測神經性毒劑[30]，2017年，Kim等[46]在此基礎上合成了meso-Pyridyl-BODIPY化合物(m-py-BOD)，m-py-BOD與DCP或DECP共存于乙腈溶液時，顏色由黃色變為粉色，熒光特性發生改變。2018年，山東大學的研究人員設計并合成了一種快速響應的熒光探針，探針包含一個電子供體-受體體系，其中BODIPY部分起報告基團和羥基的作用，羥基作為神經介質模擬物的反應位點，反應前后探針的熒光特性和顏色皆發生改變，從而實現神經性毒劑的測定[47]。

3.3 配合物

有些配合物具有獨特的物理化學性質，能與神經性毒劑反應并發生顏色、熒光性質的改變。目前基于該性質用于檢測神經性毒劑的常用配合物是以鑭系元素作為中心原子的配合物。鑭系元素與特定配體結合生成的配合物具有熒光特性，這些配合物可與神經性毒劑反應發生熒光猝滅，以此對神經性毒劑進行檢測。

Menzel等[48]構建了鑭系元素的配合物，建立了裸眼檢測神經性毒劑模擬劑氟膦酸酯的方法。該配合物由銪離子(Eu3+)與四噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)雙齒配體組成(Tb3+與TTFA和鄰啡咯啉(Op)生成雙齒混合配合物)。TTFA配體在近紫外光照射下發出紅光，而Op配體在遠紫外光照射下發出綠光。在這些感光配體的輔助下，經紫外燈照射可觀察到鑭系配合物發光。水合分子對鑭系配合物有強烈的熒光猝滅作用，使用前需對Op鑭系配合物和TTFA鑭系配合物形成的薄膜進行干燥，薄膜在干燥后暴露在氟的氣氛下很快發生熒光猝滅，該方法能裸眼檢測神經性毒劑模擬劑氟膦酸酯。2008年，Shunmugam和Tew采用三聯吡啶與鑭系元素反應生成配合物[49]，G類毒劑會使該配合物發生熒光猝滅，從而達到檢測目的。此外，研究人員還探討了三聯吡啶與鑭系元素形成多種配合物的熒光特性。G類毒劑模擬劑氯膦酸二乙酯(SAS-Cl)與三聯吡啶鑭系配合物發生反應生成的產物能發出紅色熒光，其他有機磷化合物的顏色不一樣，且SAS-Cl信號強。該方法能從一系列有機磷化合物中識別出SAS-Cl。該研究找到了一種檢測G類毒劑的新型、簡單、敏感、高選擇性的配合物。

3.4 納米粒子復合物

兩種或兩種以上不同物質所形成的結合體，能表現出單一材料不具備的性質，而納米粒子本身具有許多不同于微觀粒子和宏觀物體的特性。隨著納米技術的發展，納米粒子復合物顯色劑也應用于神經性毒劑的檢測中。

2010年，西班牙瓦倫西亞理工大學Climent等[50]對雙功能化二氧化硅納米粒子的傳質控制作用在神經性毒劑顯色檢測上的應用進行了研究。合成的納米二氧化硅表面有巰基(—SH)、羥基(—OH)兩個活性亞基，正常情況下，這兩個亞基是方酸染料(SD)反應亞基，巰基與SD中間缺電子的四圓環反應誘導使芳香性減弱。—OH亞基與神經性毒劑發生反應，會抑制SD與—SH的反應，從而發生顏色變化。這兩個反應均基于親核進攻。巰基因親核性強而與SD反應，但分子空間位阻和結構阻礙了—SH與親電的模擬劑的磷原子反應。反應過程如圖2所示。含有SD的修飾硅納米粒子溶液暴露在DFP條件下，顏色為深藍色，而對照組為淡藍色。該課題組將金納米粒子應用于神經性毒劑模擬劑檢測，探索了金納米粒子聚集與分散時的顏色變化[51]。采用三芳基甲烷染料修飾金納米粒子，在神經性毒劑模擬劑存在時，三芳基甲烷可被轉換成相應的碳正離子，并引起強烈的顏色改變，納米粒子表面的電荷補償，能使納米粒子在溶液中聚集，從而產生顏色變化[52]。

圖2 雙功能二氧化硅納米粒子檢測神經性毒劑模擬劑作用機制[51]Fig.2 Mechanism of the detection of nerve agent mimics based on bifunctionalized SiO2 nanoparticles[51]

4 展 望

基于顯色反應的檢測方法是一種重要的神經性毒劑檢測方法，但目前仍有許多不足。在顯色原理上，許乃曼反應中強氧化劑也能使聯苯胺類生色，造成干擾；檢測方法方面，便攜式的分光光度計穩定性差，結果誤差大；顯色劑方面，基于納米粒子團聚的顏色變化，即使在無神經性毒劑存在的情況下，無機鹽超過一定濃度時，也會引起納米粒子的團聚，發生顏色改變，造成假陽性。為提高顯色法的靈敏度、抗干擾能力和特異性，基于顯色反應的神經性毒劑檢測方法尚需進一步的研究，其發展趨勢包括：(1)尋找新的顯色反應檢測神經性毒劑的原理，例如免疫抗體法，以提高檢測的選擇性和靈敏度；(2)現有的現場檢測手段簡單，發展新型、便攜式的檢測儀器有利于現場檢測，提高檢測方法的準確性；(3)現有的顯示劑不能完全滿足檢測要求，需研究新型顯示劑，尋找反應前后顏色變化明顯、光學物理性質獨特、選擇性好、靈敏度高的顯示劑。