水介質中二甲基姜黃素脂質體對金屬離子的熒光識別

李正義，邵丹迪，殷 樂，肖唐鑫，孫小強

(常州大學 石油化工學院，江蘇 常州 213164)

金屬離子廣泛存在于自然界和生命體中，其中Zn2+、Fe3+、Cu2+等過渡金屬離子是人體必需的微量元素，對人體內蛋白質合成、氧氣輸送以及細胞代謝等許多生理及病理過程起重要作用[1-2]。人體內金屬離子過多或過少均會引起生命體征的紊亂，因此，金屬離子的檢測對疾病的早期預防、診斷和治療有著深遠的意義[3-5]。目前檢測金屬離子的常用方法有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質譜法和伏安法等[6-8]，但這些儀器操作復雜且成本高。而熒光探針法具有操作簡單快速、成本低、選擇性和靈敏度高等優點，在生物、醫學、化學及環境領域有著重要應用[9-12]。近年來，金屬離子熒光探針的研究引起了廣泛關注，如萘酰亞胺型[13]、香豆素類[14]、羅丹明類[15]、BMC衍生物[16]等探針分子對某些金屬離子具有很好的熒光識別性能。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

ASC-J9(純度>98%)，根據文獻自制[26]；大豆卵磷脂(生物試劑，德國Lipoid公司)；膽固醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；金屬鹽及其他溶劑均為分析純。

Scientz-750F超聲波分散儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Thermo SL16R超速離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent Cary Eclipse型熒光分光光度計(美國安捷倫公司)；ZS90納米粒徑電位分析儀(英國Malvern公司)。

1.2 水溶性ASC-J9脂質體的制備

取大豆卵磷脂0.5 g、膽固醇0.05 g、ASC-J9 5.0 mg，加入適量無水乙醇溶解后，倒入茄形瓶中減壓蒸除溶劑，再加入75 mL水，置于旋蒸儀上，60 ℃常壓旋轉30 min，將瓶壁上的膜完全剝離入水中，水化完全后，置于60 ℃水浴中繼續孵化3 h，然后冰水浴超聲(525 W)分散15 min，冷卻至4 ℃，高速離心取上層液體，得到ASC-J9脂質體，置于4 ℃冰箱內保存。

1.3 ASC-J9脂質體水溶液的配制

圖1 ASC-J9脂質體的粒徑分布Fig.1 Particlesize distribution of ASC-J9 liposome

取少量ASC-J9脂質體，用乙醇稀釋后進行高效液相色譜(HPLC)測定，分析條件：流動相為乙腈 -水(體積比40∶60)，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。根據建立的ASC-J9乙醇溶液標準曲線得出ASC-J9脂質體中ASC-J9的濃度為1.009×10-4mol/L。取5 mL ASC-J9脂質體母液于10 mL容量瓶中，加水定容，得到濃度為50 μmol/L的ASC-J9脂質體水溶液。

2 結果與討論

2.1 ASC-J9脂質體的表征及水溶性能

采用薄膜分散法，按“1.2”方法制備ASC-J9脂質體，利用納米粒徑電位分析儀測得其平均粒徑為145.7 nm，分散系數為0.361。ASC-J9脂質體的粒徑分布區間較窄(圖1)，說明其粒徑分布均勻，能在水中很好地分散，有效改善了ASC-J9的水溶性。

圖2 水中ASC-J9脂質體對不同金屬離子的熒光響應Fig.2 Fluorescent responses of ASC-J9 liposome recognize different metal ions in waterexcitation wavelength：440 nm，25 ℃，550 mV

圖3 不同金屬離子對ASC-J9脂質體識別Fe3+熒光強度的影響Fig.3 Fluorescence intensity of ASC-J9 liposome toward Fe3+ influenced by various metal ions

2.2 ASC-J9脂質體對金屬離子的選擇性識別及抗干擾能力

在10 mL 濃度為50 μmol/L的ASC-J9脂質體水溶液中分別加入200 μL 0.05 mol/L的MCln(M=Ca2+、Na+、K+、Pt2+、Hg2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+)、M(NO3)n(M=Al3+、Ag+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Pb2+)、M(OAc)n(M=Ni2+、Zn2+、Cd2+)和CuSO4金屬鹽水溶液，分別測試其熒光光譜(圖2)。發現Fe3+、Fe2+及Cu2+對ASC-J9脂質體有明顯的熒光猝滅作用，除Al3+使ASC-J9脂質體的熒光略增強外，其他金屬離子對ASC-J9脂質體無明顯的熒光響應。

以Fe3+為例，進一步考察了常見的其他金屬離子和Fe3+共存時對體系中Fe3+識別的干擾情況。在10 mL濃度為50 μmol/L的ASC-J9脂質體水溶液中分別加入200 μL 0.05 mol/L的Fe3+和其他金屬離子，觀察不同共存金屬離子對ASC-J9脂質體識別Fe3+的影響(圖3)。結果顯示，除Fe2+和Cu2+外，其他金屬離子對ASC-J9脂質體識別Fe3+的影響很小。因此，后續實驗以ASC-J9脂質體識別Fe3+為模型，詳細優化了熒光識別條件并測定識別性能參數。

2.3 熒光識別條件的優化

實驗對ASC-J9脂質體濃度進行優化，發現其自身熒光越強，加入Fe3+后猝滅現象越明顯，越有利于可視化觀察。通過對比不同濃度(1.0×10-4～1.0×10-6mol/L)ASC-J9脂質體水溶液的熒光強度，最終選擇ASC-J9脂質體的最佳濃度為5.0×10-5mol/L，此時獲得的熒光強度最大。

考察了ASC-J9脂質體識別Fe3+的平衡時間。在ASC-J9脂質體水溶液中加入過量的Fe3+，測試該溶液在不同時間下熒光強度的變化。結果發現，Fe3+加入2 min后熒光基本猝滅完全，表明ASC-J9脂質體與Fe3+的絡合速度快。為充分保障作用效果，最終選擇5 min后進行熒光測試。

在ASC-J9脂質體水溶液中加入過量的Fe3+，考察了不同測試溫度(5～40 ℃)對熒光強度變化的影響。結果表明，溫度對ASC-J9脂質體識別Fe3+的影響不大，為便于檢測，實驗選擇在室溫(25 ℃)下進行檢測。

圖4 ASC-J9脂質體(50 μmol/L)熒光強度隨Fe3+濃度的變化Fig.4 Fluorescence intensities of ASC-J9 liposome changed by different concentrations of Fe3+Fe3+：0，10，20，30，40，50，60 μmol/L

2.4 Job’s曲線與熒光滴定

Job’s 曲線是確定探針與金屬絡合比的常見方法[27]。固定ASC-J9脂質體和Fe3+的總濃度為50 μmol/L，改變兩者的濃度比，以Fe3+占兩者總濃度的比例為橫坐標，前后兩次熒光強度的差值(ΔIF)為縱坐標作圖。結果表明,當Fe3+與ASC-J9脂質體的摩爾比為1∶1時，熒光強度差值最大，由此推斷Fe3+與ASC-J9脂質體以1∶1絡合。

熒光滴定結果顯示(圖4)，隨著Fe3+的加入，50 μmol/L ASC-J9脂質體的熒光強度不斷減小，當Fe3+濃度達50 μmol/L時，ASC-J9脂質體的熒光完全猝滅，進一步證實了兩者的絡合比為1∶1。

2.5 熒光猝滅類型及結合常數

采用Stern-Volmer方程判斷猝滅類型[28]：

(1)

式中，F和F0分別為存在和不存在Fe3+時ASC-J9脂質體的熒光強度；[Q]為Fe3+的濃度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數；Kq為雙分子熒光猝滅常數；τ0為不存在Fe3+時ASC-J9脂質體的熒光平均壽命。將實驗所得數據帶入Stern-Volmer方程(式1)，以F0/F為縱坐標，Fe3+的濃度為橫坐標，得到ASC-J9脂質體與Fe3+絡合的Stern-Volmer方程為y=1.59×106x-2.66，r2=0.977 1，由此得出KSV為1.59×106。一般τ0為10-8s，從而計算出Kq為1.59×1014L/(mol·s)。根據Kq> 2×1010L/(mol·s)推斷出該熒光猝滅類型為靜態猝滅。

采用Lineweaver-Burk雙倒數曲線[28]計算結合常數：

(2)

以1/(F0-F)為縱坐標，[Q]-1為橫坐標作線性回歸方程，得到方程為y=8.145 0×10-9x+7.84×10-4，r2=0.994 6，線性關系良好。計算得出ASC-J9脂質體與Fe3+的結合常數Ka為9.63×104L/mol，說明ASC-J9脂質體與Fe3+的結合能力較強。

2.6 ASC-J9脂質體識別Fe3+的線性范圍與檢出限

向ASC-J9脂質體水溶液中分別加入一系列不同濃度的Fe3+溶液，測定對應的熒光強度，以Fe3+的濃度為橫坐標，對應熒光強度為縱坐標繪制回歸方程。結果表明，Fe3+的濃度在5.0×10-7～3.0×10-5mol/L范圍內與ASC-J9脂質體的熒光強度呈良好的線性關系，線性方程為y=-15.55x+593.3(r2=0.991 8)。通過3σ(3倍空白的標準偏差)的方法[29-30]，得到ASC-J9脂質體對Fe3+的檢出限(LOD)為6.41×10-7mol/L，表明其對Fe3+的識別具有較高的靈敏度。

2.7 ASC-J9脂質體識別不同金屬離子的性能參數對比

參照上述方法，分別測得ASC-J9脂質體與Fe3+、Fe2+和Cu2+的絡合比、結合常數、檢出限及其線性范圍，結果如表1所示。ASC-J9脂質體與Fe3+和Cu2+的絡合比均為1∶1，而與Fe2+的絡合比為2∶1；且ASC-J9脂質體與Fe2+的結合能力最強，結合常數為3.65×105L/mol；ASC-J9脂質體識別3種金屬離子的檢出限均較低，檢測靈敏度較高。

表1 ASC-J9脂質體與金屬離子的絡合比和識別性能Table 1 Binding ratio and recognition performance of ASC-J9 liposome with metal ions

3 結 論

本文采用薄膜分散法制備ASC-J9脂質體，解決了ASC-J9水溶性差的問題，并將其成功用于純水介質中金屬離子的熒光識別。研究結果表明,ASC-J9脂質體能在純水介質中通過熒光猝滅的方式識別Fe3+、Fe2+和Cu2+。通過Job’s 曲線和熒光滴定確定ASC-J9脂質體與Fe3+和Cu2+的絡合比均為1∶1，與Fe2+的絡合比為2∶1；結合常數分別為KFe(Ⅲ)=9.63×104L/mol，KFe(Ⅱ)=3.65×105L/mol，KCu(Ⅱ)=2.32×105L/mol；該水溶性熒光探針能快速識別金屬離子且靈敏度高。本研究進一步拓展了ASC-J9的應用范圍，為生命體系中金屬離子的檢測提供了新的思路和參考。