高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法同時測定果汁飲品中砷、硒與鉻元素的無機形態

呂亞寧，宋 偉，沈貴蘭，金玉娟

(1.合肥海關技術中心，安徽 合肥 230022；2.食品安全分析與檢測安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230022)

同種元素的不同形態在植物體內的遷移蓄積規律不同，對人體的危害和在體內的代謝方式也有較大差異，因此重金屬元素總量往往很難表征其生物活性和危害。元素的不同化學形態所表現的生物活性、遷移性和毒理影響等有很大差異，例如六價鉻比三價鉻毒性強，砷、硒等元素的無機形態對人體有害，而其有機形態一般具有一定的功能作用[1-4]。果汁生產在原料種植、加工和儲運過程中易受到多種途徑的重金屬污染，如灌溉用水被污染后造成重金屬在果實中富集，加工設備及包裝材料中的重金屬溶出等，其中砷、鉻等是較常見的易污染重金屬元素，有必要對其危害性進行分析。另外市場上出現的大量富硒果汁中硒的形態也直接影響產品的安全性和營養價值。因此在果汁的食用安全評價中，對元素形態的分析比總量測定更有意義，但樣品基體復雜、形態化合物不穩定且含量較低，使得元素形態的分析比總量測定困難得多。

目前對食品中的元素形態研究多集中于單一元素不同形態的分析[5-11]，對多元素形態同時分析的報道較少。多元素形態同時分析測定能夠顯著提高分析效率，節約檢驗成本。但不同元素的形態同時分析難度大，主要是由于：同種元素的不同形態化合物的化學結構相似，其色譜表現相近，色譜分離有難度；不同元素的形態化合物的極性、pK值、離子化程度等有很大差異，增加了色譜分離模式選擇的難度。本文利用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法同時分析測定了As、Se、Cr 3種元素的無機形態，利用離子對試劑流動相在C8色譜柱上分離，采用動態反應池技術實現了Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的同時分析，方法的分離度好，檢出限低，前處理簡單，適用于果汁飲料中As、Se、Cr的無機形態分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜儀(Dlexar，ELAN DRC-e，美國 PerkinElmer公司)；Milli-Q Element 純水機(美國Millipore 公司)；水浴控溫搖床(德國Julabo公司)；。

硒酸根(75.1 μg/g)、亞硒酸根(68.9 μg/g)、砷酸根(0.233 μmol/g)和亞砷酸根(1.011 μmol/g)購自中國計量科學研究院；三價鉻、六價鉻的單元素儲備溶液(均為1 000 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心)；四丁基氫氧化銨、乙酸銨、乙二胺四乙酸二鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，美國Tedia公司)。

圖1 As、Se、Cr元素無機形態標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of As，Se，Cr inorganic species standardconcentration:Cr(Ⅲ)，Cr(Ⅵ)，As(Ⅴ) and Se(Ⅳ)are 100 μg/L，As(Ⅲ)and Se(Ⅵ) are 50 μg/L

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理將果汁樣品混合均勻，精確稱取 5 g于離心管中，加入20 mL 10%(體積分數)甲醇溶液，超聲 10 min，加0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液1 mL，將樣液在60 ℃恒溫水浴搖床上振蕩1 h，10 000 r/min 離心10 min，取上清液用10%甲醇定容至25 mL，取適量過濾后待測，同時做空白實驗。

1.2.2儀器條件HPLC條件：Agilent XDB-C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；進樣體積50 μL；流動相為0.1 mmol/L四丁基氫氧化銨+0.1 mmol/L乙酸銨+10% 甲醇，等度洗脫。

ICP-MS條件：同心霧化器，RF功率1 500 W，載氣流速0.75 L/min，泵速20 r/min，反應氣流量0.6 mL/min。

2 結果與討論

2.1 色譜分離模式的選擇

關于砷、硒等元素的形態分析，文獻報道多使用PRP-X100、AS-19等陰離子交換柱進行分離[5-11]，但考慮到多元素形態同時分析時，目標分析物以多種離子狀態存在，很難實現同時分離，因此本文嘗試采用反相高效液相色譜法。EDTA可以絡合Cr(Ⅲ)，絡合物在水溶液中呈陰離子狀態[12]，而流動相四丁基氫氧化銨在水中形成的正離子TBA+可與各種陰離子形成中性“離子對”，且這些離子對化合物表現出不同的親脂性，基于C8反相色譜柱對這些化合物保留能力的不同即可實現分離測定。As、Se、Cr元素無機形態標準溶液的色譜圖如圖1所示。

為保證較好的分離度，本實驗選擇在樣液處理時加入EDTA溶液，而不添加至流動相中，原因是當EDTA添加到流動相時會增加離子強度，從而降低分析物的保留[12]，導致Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的峰形變差。在相同色譜條件下，參考文獻[12]，對比了添加EDTA前后，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)響應值的變化，結果表明EDTA的添加對其他被分析物基本無影響。

2.2 流動相對色譜分離的影響

圖2 pH 7.2條件下3種元素形態化合物標液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of three element species standard solution under pH 7.2

離子對色譜中，柱有效容量取決于離子對試劑，離子對試劑濃度越大，被分析物的保留越強，因此實驗考察了流動相pH 7.2，離子對試劑四丁基氫氧化銨(TBAOH)濃度分別為0.05、0.1、0.2 mmol/L時的出峰情況。結果發現，當TBAOH濃度為0.2 mmol/L時，被分析物的分離度良好，但分析時間過長；當濃度為0.05 mmol/L時，被分析物的保留時間太短，且分離度差；而當濃度為0.1 mmol/L時，被分析物的保留時間為1.22～1.65 min，且分離度能滿足要求，最終確定TBAOH的最佳濃度為0.1 mmol/L。

有機試劑可降低流動相的極性，影響分析物與離子對試劑所形成的復合物在疏水環境的分配，并能減少柱有效容量；但在高效液相色譜儀與電感耦合等離子體質譜儀聯用時，較高濃度的有機溶劑會造成積碳嚴重和等離子體熄火，因此本實驗將甲醇體積分數控制在10%以內，設定流動相pH 7.2，TBAOH濃度為0.1 mmol/L時，考察了甲醇體積分數分別為5%、10%時分析物的保留情況。結果表明：隨著甲醇體積分數的增加，各分析物的保留時間明顯縮短，主要是因為甲醇能夠阻礙分析物與離子對試劑結合，從而影響其在C8柱上的保留。考慮到分離度與分析時間，選擇最佳流動相為0.1 mmol/L四丁基氫氧化銨+0.1 mmol/L乙酸銨+10%甲醇，該條件下各分析物均可在1～3 min內出峰，且分離度滿足要求。

2.3 電感耦合等離子體質譜測量條件

普通模式下，選擇豐度最高的硒同位素80Se及52Cr對目標元素進行測定，基線響應值達105cps數量級，無法進行正常分析，這主要是因為80Se、52Cr、75As分別會受到40Ar2+、40Ar12C+和40Ar35Cl等多聚離子的干擾。為消除它們的影響，本研究采用甲烷作為反應氣的動態反應池DRC模式，優化了氣體流速和RPq值。優化實驗中分別對空白溶液和標準溶液進行分析，選擇背景等效濃度為10 μg/L 時為最優條件，優化后得到監測離子分別為52Cr+、78Se+、75As+，反應氣流量0.6 mL/min，RPq為0.45。

2.4 線性范圍與檢出限

將6種形態化合物配成含Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的混合標準溶液，其質量濃度范圍分別為5～100、5～100、2～100、2～100、20～100、20～100 μg/L。在最佳的儀器條件下進行測定，以各元素形態的質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，對應峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，目標分析物在上述相應的質量濃度范圍內具有較好的線性關系，相關系數均大于0.995。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限，Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的檢出限分別為0.34、0.20、0.50、0.40、0.82、0.90 μg/L。以S/N=10計算得到定量下限分別為0.006、0.003、0.009、0.007、0.014、0.015 mg/kg。

2.5 實際樣品分析

為驗證本方法的實際應用能力，對不同的果汁樣品進行測定。結果表明，蘋果汁未檢出該6種形態；藍莓汁檢出Cr(Ⅲ)和Se(Ⅳ)，含量分別為0.007、0.015 mg/kg；雜糧汁檢出Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)和Se(Ⅳ)3種形態，含量為0.008～0.034 mg/kg。為考察該方法的準確性，對3種果汁樣品進行加標回收實驗，幾種元素無機形態的加標回收率為79.5%～112%，相對標準偏差(RSD)小于5.0%，結果見表1。GB 2762-2017對果蔬、谷物等食品中總砷、無機砷、總鉻的限量在0.2～1.0 mg/kg之間，根據料液比折算，各檢測值均低于限量要求。

表1 3種果汁樣品的分析結果Table 1 Analytical result of three kinds of fruit juice samples

*no detected

3 結 論

本文建立了同時分析果汁飲料中Cr(Ⅵ)、Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)的離子對色譜-電感耦合等離子體質譜法，以0.1 mmol/L四丁基氫氧化銨、0.1 mmol/L乙酸銨和10%甲醇為流動相，并調整pH值至7.2，利用C8色譜柱對該6種無機形態化合物進行分離，解決了離子色譜中不同元素形態因離子狀態不同而無法同時分析的問題。方法檢出限為0.20～0.90 μg/L，RSD均小于5.0%，實際樣品分析顯示富硒藍莓汁中有微量的Cr(Ⅲ)和Se(Ⅳ)檢出，雜糧汁有Cr(Ⅲ)、As(Ⅲ)和Se(Ⅳ)檢出，各無機形態含量水平低無風險。該方法回收率高、操作簡單、靈敏度高，可為元素形態分析提供借鑒。