氣相色譜-三重四極桿串聯質譜檢測尿樣中神經性毒劑代謝產物烷基膦酸類化合物

楊 旸 ，閆 瓏 ，李曉森，袁 鈴，邢中方 ，劉石磊*

(1.軍事科學院防化研究院分析測試中心，北京 102205；2.國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205)

化學武器(CWAs)具有殺傷起效快、中毒途徑多、持續時間長和殺傷范圍廣等特點且制造原料易得，生產技術簡便，具有“窮國原子彈”之稱，曾在兩伊戰爭中被使用。1997年，國際《禁止化學武器公約》正式生效，對禁止化學武器的生產、使用和貯備進行了詳細規定。然而隨著國內外恐怖主義組織活動的日漸猖獗，化學武器作為一種造價低且殺傷性強的恐怖活動工具頻頻登上歷史舞臺，危害人類的和平與健康?；瘜W武器主要分為神經性毒劑、糜爛性毒劑、全身中毒性毒劑、失能性毒劑和窒息性毒劑，其中，神經性毒劑(Nerve agents，NAs)的毒性和殺傷力最強，種類較多、作用機理復雜、功效特殊且發揮毒性快，因此對神經性毒劑的中毒確證一直是國內外防化研究的重點。

神經性毒劑屬于有機磷酸酯類化合物，對神經組織內的乙酰膽堿酯酶有強烈抑制作用，可導致神經系統內化學遞質乙酰膽堿大量蓄積，并引起膽堿能神經過度興奮，使動物或人因呼吸衰竭、循環衰竭或驚厥而死亡。神經性毒劑中毒初期，其生物標志物主要以毒劑原型和水解產物為主，這些化合物在體內濃度高，易于監測，是具有較好靈敏度的生物標志物[1-3]。其中，神經性毒劑進入人體內會迅速發生水解反應，生成烷基膦酸類化合物(如表1)，并主要存在于尿液中，部分存在于血液中。由于烷基膦酸類化合物有較高的極性和沸點，使用氣相色譜-質譜(GC-MS)分析時不易在進樣口被氣化，影響其分析檢測，故需用氟類試劑對生物樣品中提取出的烷基膦酸先進行衍生化[4-5]。

表1 典型的神經性毒劑在人體尿液中對應的烷基膦酸類代謝產物Table 1 Alkyl phosphoric acids corresponding to metabolites of nerve agents in urine

由于尿樣中代謝產物烷基膦酸類化合物[6]的含量很低，且生物樣品基體復雜，內源性干擾物質較多，因此高效快速的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測手段[7-8]是開展神經性毒劑溯源研究的難點。目前，對尿液中烷基膦酸類化合物的檢測均基于液相色譜-質譜(HPLC-MS)技術[9-10]，但該技術對于甲基膦酸等分子量小、極性強的膦酸類化合物，存在因色譜保留時間靠前而受到的干擾大、離子化效率低等不足，而使用GC-MS技術可對該類型化合物的檢測起到補充作用。烷基膦酸為強極性化合物，在氣相色譜柱上保留較弱，可通過衍生化處理[11-12]改善色譜保留行為。本研究采用尿液酸化[13]、固相萃取柱富集純化[14-15]、五氟芐基溴衍生等樣品前處理手段有效獲得目標物，并建立了快速鑒定尿液中烷基膦酸類化合物的氣相色譜-三重四極桿串聯質譜方法[16]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Trace GC Ultra TSQ quantum XLS氣相色譜-三重四極桿串聯質譜儀，配自動進樣器、CI化學源和工作站(美國賽默飛世爾公司)；電子分析天平(德國塞多利斯，萬分之一)；Eppendorf AG 22331離心機(德國Eppendorf公司)。

甲基膦酸(MPA，純度95%)、甲基膦酸乙酯(EMPA，純度95%)、甲基膦酸片吶基酯(PMPA，純度96%)、甲基膦酸異丙酯(IMPA，純度96%)和甲基膦酸丁酯(BMPA，純度97%)均由防化研究院四所提供；健康尿樣由中國人民解放軍301醫院提供；陽離子交換柱(Oasis 500 mg/3 mL)；陰離子交換柱(Oasis 500 mg/3 mL)；乙腈(色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司)；五氟芐基溴(PFBBr，純度99%，美國Sigma-Aldrich 公司)；甲酸(純度>98%，美國J&K公司)；乙腈(純度>98%，美國J&K公司)；其它試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜條件色譜柱：DB-17MS彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣；恒流模式；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；不分流進樣；柱溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃后保持5 min。

1.2.2質譜條件化學(CI)離子源，負離子檢測方式；溶劑延遲5.0 min；離子源溫度200 ℃；電離能量70 eV；反應氣為甲烷，反應氣流量1.5 mL/min；碰撞氣為氬氣，壓力為133.322 Pa；掃描方式為選擇反應監測(SRM)，掃描時間均為0.05 s，質譜采集參數見表2。

表2 5種烷基膦酸化合物衍生產物的質譜采集條件Table 2 MS parameters of 5 alkyl phosphoric acid derivatives

1.2.3標準溶液的配制精密稱取5種烷基膦酸50.0 mg置于5 mL容量瓶中，用乙腈定容，制得10.0 g/L的烷基膦酸儲備液。將儲備液用乙腈逐級稀釋成100、10、1、0.1 mg/L的標準工作液。

精密吸取100 μL上述烷基膦酸標準工作液，加至10 mL人尿液中，混勻，分別獲得質量濃度為1 000、100、10、1 μg/L的加標尿液；另將100 μL乙腈加至10 mL人尿液中后進行平行操作，并作為陰性對照。

配制的標準工作液和加標尿液儲存于3～5 ℃。

1.2.4樣品的處理①取加標尿樣和空白尿樣各0.5 mL，加入約20 μL 1 mol/L鹽酸溶液，將尿樣調至pH 4.0，25 ℃靜置20 min，以16 000 r/min離心10 min，移取上清液備用。②用2 mL水活化陽離子交換柱(500 mg/3 mL)，以0.5 mL/min流速將①中制備的上清液載入并通過陽離子交換柱，用1 mL 甲酸-水(1∶100,體積比)淋洗萃取柱，合并流出液和淋洗液，用約140 μL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調至pH 10.0。③用2 mL甲醇、2 mL水依次活化陰離子交換柱(500 mg/3 mL)，以0.5 mL/min流速將②中制備的液體載入并通過陰離子交換柱，用2 mL水淋洗萃取柱并使用微弱的氮氣流吹干柱床，1 mL 甲酸-甲醇(1∶9,體積比)洗脫萃取柱，收集洗脫液。④使用微弱的氮氣流將③中得到的洗脫液吹至近干，加入1 mL乙腈復溶后，再加30 μL PFBBr和30 mg碳酸鉀，于90 ℃下衍生1 h。衍生完成后，用氮氣將衍生溶液吹干，用0.5 mL二氯甲烷復溶，待測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

考慮到烷基膦酸類化合物的衍生產物在高溫下不穩定，存在分解后在進樣口及色譜柱殘留等問題，實驗對色譜進樣口溫度進行了優化。以甲基膦酸異丙酯為例，取10 mg/L的甲基膦酸異丙酯標準溶液，將其氟化衍生后進行質譜分析，測試色譜進樣口溫度在180、200、250、280 ℃時的色譜峰強度。結果表明，隨著進樣口溫度的升高，衍生產物氣化量增大，色譜峰強度也隨之增強，但溫度大于250 ℃時，衍生產物分解，并最終在進樣口殘留，且色譜峰強度有所降低，所以選擇250 ℃作為最佳的進樣口溫度。

實驗對升溫程序進行了優化，取10 mg/L的5種混合烷基膦酸標準溶液，將其氟化衍生后進行質譜分析，兼顧5種目標物的分離度和分析時間，最終選擇20 ℃/min為優化的梯度升溫速率。

2.2 質譜條件的優化

取10 mg/L的甲基膦酸異丙酯標準溶液，按照“1.2.4”步驟，采用不分流進樣方式，化學離子源(CI)，優化了各烷基膦酸類化合物的反應氣流量(0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min)。結果表明，隨著反應氣流量的增大，目標物的色譜峰強度逐漸增強，但由于反應氣流量增大后會造成基線過高，導致色譜峰的信噪比有所降低，所以選擇最佳反應氣流量為1.5 mL/min。

實驗對定性離子的碰撞能量也進行了優化，結果顯示，5種烷基膦酸氟化衍生產物的色譜響應值隨著碰撞能量的改變而發生變化，最終選擇的最佳碰撞能量見表2。

2.3 樣品前處理的優化

因尿樣中烷基膦酸類化合物含量很低，且基質中的含氮類化合物對檢測干擾大，所以對目標物的富集純化尤為重要。采用固相萃取柱對烷基膦酸類化合物進行富集，以甲基膦酸異丙酯為例，比較了硅膠柱、C8柱、HLB柱3種不同填料的固相萃取柱。結果發現，由于烷基膦酸類化合物的極性較強，3種萃取柱的流出液、淋洗液、洗脫液在氟化衍生后均檢出了目標物，且干擾較大。鑒于目標物的極性以及尿樣中含氮類化合物的干擾，實驗將尿樣酸化使含氮類化合物成為帶正電荷的銨鹽，再用陽離子交換柱去除，合并流出液和洗脫液，混合液中的烷基膦酸類化合物被電離成陰離子后，再用陰離子交換柱進行富集，收集洗脫液進行氟化衍生檢測，此時獲得的目標物色譜峰強度較好，干擾也較小。

2.4 方法學考察

2.4.1標準曲線及定量下限采用外標法定量，取不同濃度的系列混合標準溶液，以待測物的質量濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，得到5種烷基膦酸類化合物的線性方程。以信噪比(S/N)≥3確定方法的檢出限(LOD)，以S/N≥10確定方法的定量下限(LOQ)。各烷基膦酸化合物的線性范圍、相關系數及定量下限結果列于表3。結果顯示，5種烷基膦酸均在較寬的線性范圍內具有良好的線性關系，能夠對未知樣品進行準確定量。且5種烷基膦酸的檢出限和定量下限基本可達到 μg/L水平，其中甲基膦酸片吶基酯由于磷手性中心而分裂成兩個色譜峰，導致其檢出限和定量下限在5種烷基膦酸中最高。

2.4.2精密度配制高、中、低3個濃度水平的混合標準溶液，平行測定6次，計算各烷基膦酸類化合物峰面積的相對標準偏差(RSD)，測得日內精密度。連續測定3日，計算各烷基膦酸化合物峰面積的RSD，測得日間精密度。測定結果如表3所示。從表中可以看出，使用該方法測得的樣品的日內和日間精密度的RSD均低于5%，說明儀器條件、衍生方法具有較高的可靠性。

2.4.3準確度取空白尿樣，分別加入高(7倍LOQ)、中(5倍LOQ)、低(3倍LOQ)3個濃度水平的混合標準溶液，按照“1.2.4”方法進行樣品處理，平行測定6次，計算各烷基膦酸化合物的加標回收率，結果如表3所示。從表中可以看出，3個不同濃度水平的5種烷基膦混合加標回收率為97.3%～98.9%，說明該方法有著較好的專屬性，可同時處理含有5種目標烷基膦酸的樣品。

2.4.4重復性取空白尿樣，分別加入高、中、低3個濃度水平的混合標準溶液，按照“1.2.4”方法進行樣品處理，平行測定6次，計算各烷基膦酸化合物峰面積的RSD，結果如表3所示。從表中可見，5種烷基膦酸的重復性RSD為5.3%～10%，說明基質對目標物有較大干擾，導致檢測結果的重復性稍差。

表3 5種烷基膦酸化合物的考察結果Table 3 Analytical performance of 5 alkyl phosphoric acid derivatives

2.5 國際禁止化學武器公約組織提供的未知染毒樣本分析

按照本方法測定了國際禁止化學武器公約組織(OPCW)提供的3個尿液樣本(UA、UB、UC，空白尿液自備)。取染毒尿樣0.5 mL，按照“1.2”方法進行樣品處理和儀器分析，在UA、UB、UC 3個尿液樣本中均檢出IMPA和MPA，其檢出質量濃度分別為20、50、30 μg/L和25、25、25 μg/L。其中UA樣本的定性離子對色譜圖如圖1所示。

3 結 論

本文建立了人染毒尿樣中神經性毒劑代謝產物烷基膦酸化合物的檢測鑒定方法，包括鹽酸酸化、離子交換柱純化、五氟芐基溴衍生等樣品制備方法，以及氣相色譜-三重四極桿串聯質譜準確檢測烷基膦酸的高靈敏度和專屬性方法。應用此方法，能夠在神經性毒劑染毒尿樣中準確檢出μg/L水平的烷基膦酸；實現了痕量神經性毒劑中毒后尿樣的溯源檢測，并成功用于未知濃度神經性毒劑染毒尿樣品的鑒定。本方法可靠性強、易操作且具較強的適用性，適用于神經性毒劑中毒后的溯源檢測。