四磺化酞菁鋅與白蛋白復合物的制備、光譜性質與光動力活性研究

張麗娟，鄭碧遠，李洪才，黃劍東*

(1.福建生物工程職業技術學院 藥學系，福建 福州 350002；2.福州大學 化學學院，福建 福州 350116)

圖1 ZnPcPS4的分子結構Fig.1 Molecular structure of ZnPcPS4

光動力療法(Photodynamic therapy,PDT)作為一種新興的癌癥治療手段，因獨特的優點而顯示出良好的臨床應用前景[1-5]。酞菁因具有光敏化能力強、暗毒性低和易于結構修飾等優點，被廣泛用作新一代抗癌光敏劑[6-9]。研究發現，酞菁配合物雖光敏活性較強，但對腫瘤組織的選擇性和富集能力有限[10]。血清白蛋白是一種運載蛋白，可與許多化合物結合，在體內起到轉運的作用，且對某些類型的癌細胞具有一定的靶向作用[11]。因此，研究酞菁配合物與白蛋白的相互作用及兩者復合物的制備，對提高光敏劑的光敏活性和靶向性具有重要意義[12-14]。本課題組合成了具有光敏活性的1,8,15,22-四(4-磺酸基苯氧基)酞菁鋅四鈉鹽(記為ZnPcPS4，結構式見圖1)[15]。本文重點研究了ZnPcPS4與白蛋白的相互作用，制備了兩者的非共價復合物，比較了復合前后光譜性質的變化，并研究了復合物對人肝癌細胞HepG2的光動力抑制作用，以期為構建具有靶向功能的酞菁基光敏劑提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FL900/FS920型熒光光譜儀(英國Edinburgh公司)；UV-2450 紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；TCS SPE熒光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)均為北京鼎國昌盛生物技術公司產品；色譜柱所用填料為Sigma公司葡聚糖G-100凝膠；ZnPcPS4為本實驗室合成，并經核磁共振、質譜和元素分析等表征確定。

1.2 磺化酞菁與白蛋白相互作用的光譜研究

1.2.1電子吸收光譜在室溫下，取2.0 mL PBS溶液于1 cm石英比色皿中，滴加8 μL濃度為2 mmol·L-1的磺化酞菁溶液(終濃度為8 μmol/L)，以PBS溶液為參比，對體系的電子吸收光譜進行測定，然后在上述體系中滴加一定濃度梯度的白蛋白溶液，考察體系中的電子吸收光譜變化情況[16-17]。

1.2.2穩態熒光光譜用移液器取2.0 mL白蛋白溶液于1 cm石英比色皿中，逐次滴加一定濃度的磺化酞菁溶液(累加體積小于220 μL，以減少體積變化引起的影響)，依次測定混合溶液中的蛋白質熒光發射光譜，激發波長為280 nm，掃描范圍為300～500 nm。記錄白蛋白的熒光強度隨酞菁濃度遞增的變化幅度，計算結合常數和結合位點數。

1.2.3相互作用常數根據文獻方法[18]，在靜態猝滅情況下，根據下式估算酞菁配合物與白蛋白的結合常數和結合位點數。

其中，F0為不存在猝滅劑(指磺化酞菁配合物)時蛋白質的內源熒光強度，F為加入猝滅劑后的熒光強度，CQ為猝滅劑的濃度，KA為結合常數，n為結合位點數。由線性關系作圖，通過直線的截距和斜率分別求出酞菁配合物與蛋白質的結合常數KA和結合位點數n。

1.3 復合物制備

參照文獻方法[19]，通過溫育交換法制備磺化酞菁鋅與白蛋白的非共價復合物。磺化酞菁鋅與白蛋白以一定的摩爾比在PBS緩沖溶液(pH 7.4)中混合均勻，于37 ℃下在氣浴搖床上溫育過夜后，通過G-100葡聚糖凝膠色譜分離純化，以PBS緩沖液為流動相，由電子吸收光譜監控洗脫成分，收集復合物對應的洗脫組分，并通過冷凍干燥除去溶劑。復合物中白蛋白的含量通過考馬斯亮藍法(CBB法)測定，磺化酞菁含量則通過電子吸收光譜法測定(將其稀釋于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，通過Q帶的吸光度計算)。

1.4 離體光動力抗癌活性

按文獻方法[20]，將復合物ZnPcPS4-BSA先用PBS溶解，配制成約80 μmol/L的母液，然后過0.22 μm濾膜；ZnPcPS4則先溶于DMF中配制成1 mmol/L溶液，用PBS稀釋至80 μmol/L，再用培養基稀釋至相應的濃度進行實驗。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法，檢測磺化酞菁及其白蛋白復合物的離體光動力抗癌活性。

1.5 熒光成像法測試細胞攝取

圖2 ZnPcPS4電子吸收光譜隨BSA濃度的變化(A)及CBSA/CZnPcPS4比值與ZnPcPS4 Q帶最大吸收強度的關系(B)Fig.2 Change in electronic absorption spectra of ZnPcPS4 with BSA concentration(A)and Q band maximum absorbance insentity of ZnPcPS4 with CBSA/CZnPcPS4(B)CZnPcPS4=8.0 μmol/L；CBSA:0,0.87,1.75,2.61,3.48,4.34,5.21,6.08,6.95,7.82,8.69,17.38 μmol/L;PBS solution

圖3 ZnPcPS4對BSA熒光光譜的影響Fig.3 Change in fluorescence spectrum of BSA concentration with ZnPcPS4(excited at 280 nm)PBS buffer；insert：fitting curve of fluorescence quenching caused by ZnPcPS4；CBSA=20.4 μmol/L,CZnPcPS4=0,0.91,1.82,2.72,3.63,4.54,5.45,6.36,7.26,8.17,9.08 μmol/L

采用熒光共聚焦顯微鏡測試酞菁在細胞內的熒光成像情況。將處于對數生長期的HepG2細胞接種于放置有潔凈無菌蓋玻片的培養板中，每板約1×105～2×105個細胞，在37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后，棄去舊培養基，分別加入400 μL含磺化酞菁及其白蛋白復合物(2 μmol/L)的培養基繼續培養2 h后，用PBS洗滌細胞2次，再用400 μL PBS覆蓋后進行熒光共聚焦顯微鏡拍照。光敏劑用635 nm激發，收集645～750 nm的熒光。圖片用SPE ROI熒光分析軟件進行處理，每個樣品計數20個細胞的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 白蛋白對ZnPcPS4吸收光譜的影響

磺化酞菁ZnPcPS4在PBS溶液中存在單體和聚集體的平衡(圖2A)，表現在650 nm處有較強的聚集體吸收峰，692 nm處則為單體特征吸收峰。隨著BSA濃度的增大，酞菁的存在狀態由聚集體向單體轉化，說明酞菁和BSA之間存在相互作用，而光敏劑以單體形式存在才能有效發揮其光敏活性。同時隨著BSA的加入，ZnPcPS4的Q帶最大吸收波長從692 nm紅移至696 nm，光譜紅移有利于光動力治療。

圖2B為酞菁ZnPcPS4在696 nm的吸收強度與CBSA/CZnPcPS4的關系圖。從圖中可見，當CBSA/CZnPcPS4=1時，ZnPcPS4在696 nm的特征吸光度接近最大，當濃度比大于1之后，隨著BSA的加入，酞菁的特征吸光度增加緩慢，說明ZnPcPS4和BSA的非共價結合組成比可能為1∶1。另外，筆者發現，ZnPcPS4與HSA的相互作用和非共價結合比，均與ZnPcPS4和BSA類似。這說明可以用來源豐富且價格較低的BSA代替HSA，模擬酞菁與白蛋白的相互作用。

2.2 ZnPcPS4對白蛋白熒光光譜的影響

考察了酞菁ZnPcPS4對BSA內源熒光的影響。結果顯示，在ZnPcPS4逐滴加入BSA溶液的過程中，BSA在340 nm的特征熒光強度呈規律性的減弱(見圖3)，這說明酞菁對BSA有一定的猝滅作用。BSA的最大熒光發射峰波長均發生藍移，特征熒光峰的位置和強度發生了明顯變化，表明ZnPcPS4與BSA之間存在較強的相互作用。實驗考察表明，ZnPcPS4對HSA內源熒光的影響與BSA類似。

按照靜態猝滅公式lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgCQ，對ZnPcPS4猝滅白蛋白熒光數據進行擬合，結果見圖3插圖。分別通過直線的截距和斜率，求出ZnPcPS4與白蛋白相互作用的結合常數KA和結合位點數n。ZnPcPS4與BSA的結合常數為6.72×106L/mol，結合位點數為1.30；ZnPcPS4與HSA的結合常數為4.36×106L/mol，結合位點數為1.30。KA值均較大，說明ZnPcPS4與白蛋白之間存在較強的相互作用。

近年來本課題組合成的酞菁鋅與白蛋白的非共價結合常數和結合位點數見表1[21-22]。由表1可見，ZnPcPS4與兩種白蛋白的結合能力最強，磺化酞菁與白蛋白的相互作用顯著。十六羧基酞菁鋅ZnPc(COOH)16比單羧基酞菁鋅ZnPcC1的結合常數大，其與白蛋白的相互作用強于單羧基酞菁鋅。結果表明，酞菁環上取代基的結構和數目對酞菁與白蛋白的相互作用能力有顯著影響。

表1 酞菁和BSA(HSA)的結合參數Table 1 The parameters of complexes binding to BSA and HSA

2.3 ZnPcPS4在白蛋白中的結合位點

參照文獻方法[23],應用競爭點位標記置換法研究了酞菁與白蛋白相互作用的結合位點。分別用氯化血紅素(Hemin)、水楊酸鈉(NaA)及布洛芬(ⅠB)作為蛋白質亞域ⅠB、亞域ⅡA(位點Ⅰ)和亞域ⅢA(位點Ⅱ)的競爭位點標記物。如圖4所示，ZnPcPS4在PBS中的熒光強度較弱，而BSA的加入促使酞菁聚集體向單體轉化，熒光強度顯著增強。但將Hemin加至ZnPcPS4-BSA體系后，熒光強度大幅降低，在相同條件下，水楊酸鈉和布洛芬則對ZnPcPS4-BSA體系的熒光光譜無影響。采用電子吸收光譜測定，也得到類似結果。這表明Hemin置換了與BSA結合的ZnPcPS4，即ZnPcPS4和BSA相互作用的結合位點主要為亞域ⅠB。

2.4 ZnPcPS4與白蛋白復合物的制備

以摩爾比約為4∶1將ZnPcPS4和牛血清白蛋白均勻混合，通過溫育交換法制備復合物。圖5為復合物ZnPcPS4-BSA在凝膠色譜中的分離洗脫曲線。其中，洗脫體積為12～18 mL時洗脫液呈綠色的組分既有696 nm的酞菁特征吸收峰，又有340 nm的白蛋白特征熒光發射峰，應為酞菁-白蛋白非共價復合物。采用相同方法制備ZnPcPS4-HSA復合物，其洗脫體積13～18 mL的餾分為復合物。

圖5 ZnPcPS4-BSA復合物的流出曲線Fig.5 Elution profiles of ZnPcPS4-BSA conjugate as monitored absorbance at 696 nm and fluorescence emission at 340 nm upon excitation at 280 nm

圖6 ZnPcPS4(A) 和ZnPcPS4-BSA(B)對肝癌細胞HepG2的細胞毒性Fig.6 Cytotoxic effects of ZnPcPS4(A) and ZnPcPS4-BSA(B) conjugates on HepG2 cells

對于分離純化后的非共價復合物，分別通過電子吸收光譜和考馬斯亮藍法測定酞菁ZnPcPS4和白蛋白的含量，求得復合物中酞菁和白蛋白的摩爾比約為1∶1。

2.5 復合物的光譜性質

以復合物 ZnPcPS4-BSA為例，比較了復合物ZnPcPS4-BSA(11.0 μmol/L)與游離ZnPcPS4(11.0 μmol/L)在PBS緩沖液中的電子吸收光譜。與游離的酞菁相比，復合物中酞菁的Q帶吸收峰較強且相對尖銳，說明在復合物中酞菁主要以單體形式存在，聚集程度降低。ZnPcPS4-BSA的Q帶吸收波長發生紅移(從692 nm紅移至696 nm)，原因可能是酞菁和白蛋白相互作用，使酞菁環之間的π-π堆積程度降低，從而使酞菁部分解聚，單體酞菁含量增高。另外，由于波長越長的光越能夠更好地穿透人體組織，因此光譜紅移有益于光動力治療。

2.6 離體抗癌活性研究

進一步比較了復合物ZnPcPS4-BSA和其對應的游離ZnPcPS4對人肝癌細胞HepG2的光動力抑制作用(圖6)。在測試濃度內，化合物對HepG2細胞均無暗毒性，而在光照條件下，均對HepG2細胞具有明顯的生長抑制作用，且抑制作用呈濃度依賴性。表明該化合物無化療作用，只有在光激發下才產生毒性殺死癌細胞，采用特定波長的激光照射腫瘤組織，可靶向殺死癌細胞，減少副作用。復合物ZnPcPS4-BSA的IC50值僅為1.68 μmol/L，活性明顯高于其對應的游離ZnPcPS4(IC50=2.73 μmol/L)。這說明復合物的抗癌活性比其對應的游離酞菁強。

為進一步研究導致ZnPcPS4 和ZnPcPS4-BSA抗癌活性出現明顯差異的原因，利用熒光共聚焦顯微鏡研究了其細胞攝取。如圖7所示，ZnPcPS4-BSA在細胞內的熒光強度明顯強于其對應的游離ZnPcPS4，為后者的4.4倍。由于ZnPcPS4-BSA在生理條件下的Q帶最大吸收強度僅比ZnPcPS4略大(增大不足2倍)，因此它們在細胞內熒光強度的4.4倍差別也反映了其細胞攝取差異，即ZnPcPS4-BSA復合物被肝癌細胞攝取的能力明顯高于單純的ZnPcPS4，這可能是因為白蛋白可通過癌細胞表面受體進行主動轉運。因此，復合物ZnPcPS4-BSA相比于游離ZnPcPS4具有較高的光動力抗癌活性，可歸因于其具有更高的癌細胞攝取率。

3 結 論

本文通過電子吸收光譜和熒光光譜研究了α位四磺化酞菁鋅ZnPcPS4與白蛋白的相互作用。結果表明，ZnPcPS4和白蛋白之間存在較強的相互作用，結合常數為106數量級，結合位點數為1.30，白蛋白可使ZnPcPS4的聚集體向單體轉化。并通過溫育交換法制備了ZnPcPS4和白蛋白的摩爾比約為1∶1的ZnPcPS4-BSA和ZnPcPS4-HSA復合物。光譜研究表明，ZnPcPS4與白蛋白復合后展現出比游離ZnPcPS4更明顯的單體特征吸收峰，復合物的Q帶最大吸收波長紅移，這將有利于光動力治療作用。復合物ZnPcPS4-BSA對HepG2細胞的光動力抑制效應結果表明，復合物ZnPcPS4-BSA的IC50值為1.68 μmol/L，活性明顯高于其對應的游離ZnPcPS4，這可能是由于白蛋白對某些癌細胞的靶向性，使得復合物具有更高的癌細胞攝取率。研究表明該類復合物有望發展為具有靶向功能的抗癌光敏劑，為新型靶向抗癌光敏劑的開發提供有益參考。