QuEChERS/LC-MS/MS法測定食品中7種真菌毒素

熊 欣，劉 青，張廣文，龐世琦，曾廣豐，陳文銳

(1.暨南大學 理工學院，廣東 廣州 510632；2.廣東出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623；3.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

真菌毒素是由真菌產生的次級代謝產物，在食品生產、儲存、加工和流通環節均可能因保存條件不當而造成真菌毒素污染[1]，其中黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)和赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是常見的兩類真菌毒素。這兩類毒素均具有致癌、致畸和神經毒性作用[2-3]。黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性作用靶器官主要是肝臟，會造成嚴重的肝損傷或誘發肝癌，甚至致死[4]。赭曲霉毒素A(OTA)主要危及人和動物腎臟，會對腎臟造成損害，還可導致神經中毒[5]。AFB1和OTA分別被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)定義為Group 1B類和Group 2B類致癌物[6]。我國《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2017)[7]中規定了食品中允許的真菌毒素最高限量，其中AFB1在谷物中的限量為5.0 μg/kg，在花生及其制品中為20.0 μg/kg，OTA在谷物中為5.0 μg/kg。

食品中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的檢測方法主要有熒光檢測法[8-9]、酶聯免疫吸附法[10]、液相色譜法[11]、液相色譜-質譜法[12-14]等。由于食品成分復雜，目前較為常用的凈化富集方法有固相萃取柱凈化法[15]與免疫親和柱凈化法[16-17]。這兩種方法回收率高、重復性好，但分析成本高，不適于大批量樣品檢測。QuEChERS是由美國化學家Lehotay和德國的Anastassiadas[18]在固相萃取基礎上提出的新技術，因具有快速、簡便、經濟等特點在農獸藥殘留檢測領域得到廣泛應用[19-20]。近年來，開始逐漸應用于真菌毒素檢測[21-23]。目前國內對赭曲霉毒素的檢測研究主要集中于OTA的測定，對赭曲霉毒素B(OTB)的研究相對較少，尚無對赭曲霉毒素C(OTC)的相關研究報道。OTC是OTA的前體物，OTB則是OTA的脫氯衍生物。OTC和OTA的毒性相當，OTB相對較弱。在酒精或酸性環境下，OTA羥基酸轉化成乙醇酯OTC，通過口服和注射，OTC能夠迅速水解成OTA[24]，表現出OTA和OTC之間的協同毒性作用。由于同一種真菌幾種代謝產物的共同出現可能會對人體或動物的健康產生更復雜的影響，甚至表現出對人體的協同毒性作用。因此在自然條件下，混合了幾種真菌代謝產物的食品污染是必須要考慮的。

本文分別對大米、餅干、花生油等5種代表性食品基質中AFB1、AFB2(黃曲霉毒素B2)、AFG1(黃曲霉毒素G1)、AFG2(黃曲霉毒素G2)、OTA、OTB和OTC 7種真菌毒素的前處理方法和檢測條件進行優化，建立了QuEChERS凈化技術結合高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)同時檢測上述7種真菌毒素的方法，其中對OTC的檢測為國內首次報道。該方法靈敏度高、重現性好，降低了檢測成本，提高了檢測效率，能滿足實際工作中大批量樣品的檢測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RM S.3振蕩器、VORTEX4渦旋混勻器(德國IKA公司)；3-16PK冷凍離心機(美國Sigma公司)；API3500 QTrap 高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(美國AB公司)； Turbo Vap LV 吹氮濃縮儀(瑞典Biotage公司)； SW30h超聲波清洗儀(瑞士Sono Swiss公司)。

黃曲霉毒素總量標準品(5 mg/L，B1∶B2∶G1∶G2= 4∶1∶4∶1，美國Trilogy公司)；赭曲霉毒素A(OTA)標準品(10 mg/L，美國Trilogy公司)；赭曲霉毒素B(OTB)標準品(10 mg/L，美國Romer Labs公司)；赭曲霉毒素C(OTC)標準品(10 mg/L，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；乙腈(色譜純)、乙酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)、乙酸銨、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸氫二鈉倍半水合物、無水硫酸鎂、C18dSPE分散劑、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、中性氧化鋁(Al-N)、石墨化炭黑(GCB)、弗羅里硅土、氨基硅膠(NH2)，均購于德國CNW Technology公司；氯化鈉、二氧化硅、甲酸(分析純，廣州化學試劑廠)；實驗用水符合 GB/T 6682-2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》中一級水的規定。淀粉類食品、焙烤類食品及花生制品基質的樣品，均為通過超市購買、日常法定委托等收集到的樣品。

1.2 標準溶液的配制

將7種毒素標準樣品用甲醇配成1 000 μg/L的混合標準儲備液，置于4 ℃冰箱內保存。實驗時現配成工作標準液(黃曲霉毒素總量:2.5、5.0、12.5、25.0、50.0、125.0 μg/L；赭曲霉毒素A、B、C:1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0 μg/L)。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)色譜柱；柱溫:35 ℃；流速:0.4 mL/min；進樣量:10 μL；流動相:A為0.1%甲酸，B為乙腈；梯度洗脫條件:0～4.0 min，50% A；4.0～4.1 min，50%～15% A;4.1～12.0 min，15% A。

1.3.2質譜條件離子源:電噴霧離子源(ESI)；掃描方式:正離子掃描，MRM模式；毛細管電壓5.5 kV；離子源溫度550 ℃。

1.4 樣品前處理方法

精確稱取4 g(精確至0.01 g)粉碎樣品于50 mL離心管中，加入10 mL水，振蕩1 min。加入10 mL 甲酸-乙腈(10∶90，體積比)，超聲10 min。加入6.5 g鹽析劑(無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物和檸檬酸氫二鈉倍半水合物，質量比為4∶1∶1∶0.5)，立即手搖1 min，4 500 r/min離心10 min。用乙腈將有機相定容至10 mL。取8 mL上清液于15 mL離心管中(含凈化劑:1.2 g MgSO4+0.25 g C18+0.25 mg Al-N+0.4 g PSA)，手搖1 min，4 500 r/min離心5 min。

取5 mL上清液至玻璃管中(花生制品取2.5 mL)，40 ℃氮吹至干。加入1 mL 0.1%甲酸-乙腈(1∶1，體積比)復溶，渦旋1 min。過有機濾膜后待進樣分析。

圖1 不同提取劑對7種真菌毒素提取效率的影響(加標10 μg/kg，n=3)Fig.1 Effect of different extracting solvents on recoveries of 7 mycotoxins at spiking level of 10 μg/kg(n=3)A:acetic acid-MeCN(1∶99)；B:acetic acid-MeCN(5∶95)；C:acetic acid-MeCN(10∶90)；D:formic acid-MeCN(1∶99)；E:formic acid-MeCN(5∶95)；F:formic acid-MeCN(10∶90)

圖2 7種真菌毒素在不同凈化劑組合下的回收率(加標10 μg/kg，n=3)Fig.2 Recoveries of different sorbents for d-SPE clean-up of 7 mycotoxins at spiking level 10 μg/kg(n=3)A:0.4 g Al-N+0.25 g C18+1.2 g MgSO4；B:0.4 g PSA+0.25 g C18+1.2 g MgSO4；C:0.25 g Al-N + 0.4 g PSA+0.25 g C18+1.2 g MgSO4

2 結果與討論

2.1 QuEChERS前處理方法優化

2.1.1提取劑的優化赭曲霉毒素和黃曲霉毒素多使用乙腈(MeCN)為提取劑，同時加入一定量的酸進行酸化提取[25-27]。本文選取空白大米樣品，加標量為10 μg/kg，采用超聲提取方式，分別考察了不同體積比的甲酸-乙腈(1∶99、5∶95、10∶90)和乙酸-乙腈(1∶99、5∶95、10∶90)對目標物的提取效果(見圖1)。結果顯示，乙酸-乙腈體系對OTA和OTB的提取效率較差，兩者的回收率均在30%以下，甲酸-乙腈體系對7種真菌毒素有較好的回收率。綜合考慮，最終選擇甲酸-乙腈(10∶90)作為提取劑。

2.1.2提取方式的選擇以加標量為10 μg/kg的空白大米樣品為對象，考察了振蕩和超聲兩種提取方式和不同提取時間對目標物加標回收率的影響。比較了振蕩30 min、1 h，超聲提取10 min、20 min共4種提取方式。結果表明，4種提取方式對7種目標毒素均具有較好的加標回收率，提取效果無明顯區別。考慮時間成本，最后選擇超聲提取10 min。

2.1.3吸附凈化劑的優化QuEChERS前處理中常用的吸附凈化劑有PSA、GCB、C18、Al-N、NH2、弗羅里硅土和SiO2[19-23，28-29]。本實驗將加標量為10 μg/kg的空白大米樣品超聲提取10 min后，考察了上述常用凈化劑與MgSO4組合對樣品的凈化效果。結果表明:使用C18、Al-N、PSA作為吸附凈化劑的效果較好。

進一步對不同的凈化劑組合和用量進行優化(圖2)，結果表明，凈化劑組合A(0.4 g Al-N+0.25 g C18+1.2 g MgSO4)對AFB1和AFG1的吸附作用很強，導致AFB1和AFG1的回收率偏低。而另外兩組凈化劑組合對7種真菌毒素均有良好的凈化效果和回收率。綜合考慮凈化效果和回收率，最終選擇組合C(1.2 g MgSO4+0.25 g C18+0.4 g PSA+0.25 g Al-N)為最佳吸附凈化劑。

2.2 色譜-質譜條件的優化

2.2.1色譜條件的選擇考察了0.1%乙酸-10 mmol/L乙酸銨-乙腈和0.1%甲酸-乙腈兩種流動相的分離效果，發現以后者為流動相時得到的基線平穩，分離效果好，響應值高。因此，選擇0.1%甲酸-乙腈為流動相進行梯度洗脫，提取離子流色譜圖見圖3。

2.2.2質譜條件的確定對30 μg/L的混合標準溶液，以選定的質量數范圍(m/z100～800)進行一級質譜全掃描，得到目標物的母離子精確質量數，再對其進行二級質譜掃描，并優化質譜參數。依據目標物的分子式和碎片離子信息擬合出理論精確質量數。7種化合物的母離子精確質量數、保留時間，碎片離子的精確質量數以及去簇電壓和錐孔電壓參數見表1。

表1 MRM模式質譜分析參數Table 1 Parameters of mass spectrometry analysis in multiple-reaction monitoring(MRM) mode

*quantitation ion

表2 LC-MS/MS檢測7種真菌毒素的線性范圍、線性方程及相關系數Table 2 Linear range,calibration equations，correlation coefficients(r) of seven mycotoxins by LC-MS/MS

2.3 線性范圍與相關系數

按“1.2”用甲醇逐級稀釋配制不同質量濃度的7種毒素系列混合標準溶液，進行LC-MS/MS測定。以質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，響應值的峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準工作曲線。各化合物的線性范圍、線性方程和相關系數見表2。7種真菌毒素線性良好,相關系數(r)均不小于0.999。

2.4 方法定量下限、精密度與準確度

選取大米、餅干、曲奇、花生油、花生醬5種食品基質，用空白基質進行加標回收實驗，將回收率符合要求的最低加標濃度作為方法的定量下限(LOQ)。在空白樣品中分別添加0.25～40 μg/kg范圍的3個水平的混合標準溶液，按上述步驟處理，每個水平平行實驗6次，采用外標法定量，回收率和相對標準偏差(RSD)結果見表3。以加標回收率滿足要求的最低加標量為方法的定量下限，本方法的定量下限為0.25～5.0 μg/kg，平均回收率為71.5%～119%，RSD為1.1%～7.7%。

表3 7種真菌毒素的平均回收率、相對標準偏差(n=6)及定量下限Table 3 Average recoveries，relative standard deviations(RSDs，n=6) and limits of quantitation(LOQs) of 7 mycotoxins

(續表3)

SubstrateMycotoxinSpiked(μg·kg-1)Recovery/%RSD/%LOQ(μg·kg-1)AFG11,5,1093.1,90.0,86.55.7,4.9,4.61.0AFG20.25,1.25,2.5096.0,92.1,96.77.0,4.5,5.20.25BiscuitsOTA2,5,1090.5,94.2,86.25.8,5.2,3.12.0OTB2,5,1090.6,94.3,96.05.1,4.9,4.92.0OTC2,5,1093.7,91.4,96.06.4,5.8,2.72.0AFB11,5,1094.0,107,1027.0,5.5,4.01.0AFB20.25,1.25,2.5072.3,79.3,74.44.3,4.8,3.20.25AFG11,5,1079.9,87.3,91.15.2,5.2,3.51.0AFG20.25,1.25,2.5090.6,88.6,86.26.2,6.0,4.10.25CookiesOTA2,5,1094.9,93.0,90.52.4,3.7,2.82.0OTB2,5,1087.2,73.7,1195.8,6.8,3.52.0OTC2,5,1086.6,85.1,1017.4,6.9,4.12.0AFB11,5,10116,91.3,1196.2,4.3,2.41.0AFB20.25,1.25,2.5081.1,113,1093.1,5.4,4.90.25AFG11,5,1088.6,97.0,98.12.5,2.0,1.11.0AFG20.25,1.25,2.5086.2,96.2,94.06.2,5.8,5.20.25PeanutoilOTA2,5,1098.1,103,1192.3,1.3,3.72.0OTB2,5,10104,103,92.53.1,2.9,2.72.0OTC2,5,1081.6,78.0,80.04.4,3.3,3.02.0AFB15,20,4089.6,117,1043.2,3.7,4.15.0AFB21.25,5,1081.7,79.5,1025.2,4.8,4.61.25AFG15,20,4090.5,116,1073.6,4.4,3.75.0AFG21.25,5,1092.1,102,88.66.1,5.7,5.01.25Peanut butterOTA2,5,1086.8,81.7,82.76.2,5.6,5.72.0OTB2,5,1083.5,85.4,86.95.1,5.9,4.82.0OTC2,5,1075.2,72.4,74.77.1,7.7,5.72.0AFB15,20,4081.8,88.9,89.74.0,5.7,5.65.0AFB21.25,5,1073.4,78.0,75.65.7,6.4,4.41.25AFG15,20,4083.6,86.4,83.66.0,5.7,6.35.0AFG21.25,5,1077.7,71.5,73.27.6,6.9,4.21.25

2.5 與現有國家標準比較

我國食品安全國家標準GB 5009.22 和GB 5009.96[30-31]中，分別規定了食品中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的檢測方法，且采用液相色譜和液相色譜-質譜檢測時，樣品的凈化主要使用免疫親和柱法和離子交換固相萃取柱法。本方法對4種黃曲霉毒素的定量下限均高于國標方法，但均低于食品安全標準GB 2761中黃曲霉毒素的限量要求；OTA的定量下限為2.0 μg/kg，低于國標方法中OTA的定量下限3.0 μg/kg，且國標方法中未涉及OTB、OTC的檢測。相比于國標，本方法快速、簡便、成本低，更適用于日常檢測中大批量樣品的篩查。

2.6 實際樣品的篩查

采用本方法對大米、大米制品、花生制品、烘焙食品等15個樣品中的上述7種真菌毒素進行篩查。結果表明，1款購自農貿市場的花生油樣品檢出黃曲霉毒素，AFB1和AFB2檢出量分別為11.18 μg/kg和1.95 μg/kg，均低于國家限量標準要求。其余樣品均未檢出上述真菌毒素。

3 結 論

本研究建立了QuEChERS前處理結合高效液相色譜-串聯質譜聯用檢測AFB1等7種真菌毒素的方法。建立的QuEChERS前處理方法適用于多種類型的食品基質，對目標物有良好的凈化提取效果；檢測方法快速靈敏，重現性好，精密度高，能滿足大批量食品樣品中7種真菌毒素殘余量的檢測要求。由于我國目前尚未建立OTB、OTC相關限量標準，鑒于這兩種毒素存在一定的毒性累積風險，本方法為OTB與OTC的監測提供了技術依據。